基因工程操作程序.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程操作程序,第一页，共22页。,1、,基因表达载体,包括哪些必需组分？,2、将目的基因,导入,植物、动物、微生物细胞的方法分别有哪些？,3、目的基因的,检测,有哪些方法？,第二页，共22页。,二、,基因表达载体的构建,基因工程的核心,目的：,组成：,1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代，,2、使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,目的基因+启动子+终止子+标记基因,第三页，共22页。,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录,启动子：,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,第四页，共22页。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,标记基因：,有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,第五页，共22页。,寻根问底：,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：,有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,构建目的,为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。,第六页，共22页。,三、将目的基因导入受体细胞,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca,2+,处理,第七页，共22页。,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,（1）农杆菌介绍：,（2）原理,（3）适用范围,感染双子叶植物和裸子植物,具有趋化性（酚）,第八页，共22页。,适用于,单子叶植物,基因枪法,第九页，共22页。,花粉管通道法,适用于,被子植物,第十页，共22页。,2,、将目的基因导入动物细胞,（,1,）方法：,显微注射法,（,2,）程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射受精卵,早期胚胎转移到雌性动物的输卵管或子宫内,新性状动物,第十一页，共22页。,用口径为1m的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。,什么叫显微注射技术？,第十二页，共22页。,3、将目的基因导入微生物细胞,（1）原核生物特点：,繁殖快、单细胞、遗传物质少,（2）方法：,第十三页，共22页。,细菌,0,二价阳离子Ca,2+,42,用Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体,溶于缓冲液中,与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,第十四页，共22页。,微生物细胞,Ca,2+,处理,第十五页，共22页。,四、目的基因的检测与鉴定,检测,:,是否插入目的基因,是否转录,是否翻译,鉴定,:,功能活性鉴定,抗性鉴定,分别提取什么进行检测,归纳步骤,第十六页，共22页。,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入,了目的基因,过程:,A.首先取出转基因生物的基因组DNA,B.对,含目的基因的,单链,DNA片段,作放射性同位素,或荧光分子,标记，以此做探针,C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中,方法:,DNA分子杂交,第十七页，共22页。,第十八页，共22页。,第十九页，共22页。,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分 子 杂 交,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂,交带，表明目的基因转录出了mRNA.,第二十页，共22页。,3、将目的基因导入微生物细胞,检测目的基因是否转录出了mRNA,将目的基因导入植物细胞,抗体？将目的基因编码的蛋白质注射进,提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。,1、使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代，,首先取出转基因生物的基因组DNA,2、使目的基因能够表达和发挥作用。,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,交带，表明目的基因转录出了mRNA.,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,2、将目的基因导入动物细胞,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入,寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,抗原？,从转基因生物中提取的蛋白质,抗体？,将目的基因编码的蛋白质注射进,动物体内进行免疫产生的相应抗体,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原-抗体杂交,第二十一页，共22页。,鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,第二十二页，共22页。,