层析CHROMATOGRAPHY课件_60页.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,层 析,CHROMATOGRAPHY,掌握：层析的概念、一般原理,凝胶层析的基本原理,装层析柱的过程及装柱要求,熟悉：层析技术的分类,凝胶层析的特点,凝胶的结构与性质,了解：凝胶的选择,柱、样品、洗脱液的选择,凝胶的保存,一.概述,层析,Chromatography(,色谱),利用混合物中各组分的,物理化学性质间的差异,(溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等)，使各组分在支持物上,集中分布在不同区域,，借此将各组分分离。,色谱历史,古,罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）,1903,（,1906,）年，,Michael,Tswett,提出,色谱法,1931,年，,Kuhn,采用柱色谱分离了类胡萝卜素,1941,年，,Martin,和,Synge,提出分配色谱法,1944,年，,Martin,等又提出纸色谱法,1952,年，,Martin,和,James,发明了气液色谱法,1955,年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立,1956,年，,Stahl,系统研究了薄层色谱法,(TLC),1958,年，,Stein,和,Moore,研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构,1967,年，,Horvvath,和,Huber,等研制了高效液相色谱,(,high-performance liquid chromatography,HPLC,),仪,1975,年，,Small,等提出离子色谱,20,世纪,80,年代，超临界色谱,20,世纪,90,年代，毛细管电泳（,1809,年,Re,ss,第一次电泳实验）,21,世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展,层析法进行时有两个相，一个相称为,固定相,(Stationary phase),，另一相称为,流动相,(Mobile phase),。由于各组分所受,固定相的阻力,和,流动相的推力,影响,不同,，各组分移动速度也,各异,，从而使各组分得到分离,。,二.层析技术的分类,1.按两相所处的,状态,分类,以液体作为,流动相,的层析称为,液相层析,，以气体作为,流动相,的称为,气相层析,。,其,固定相,也可有两种状态，一种是以,固体,作为吸附剂的固定相，另一种是以涂布在固体载体表面的,液体,作为固定相。,层析,气相层析（,gas-chromatography）,液相层析（,liquid-chromatography）,气-固层析（,gas-solid chromatography）,气-液层析（,gas-liquid chromatography）,液-固层析（,liquid-solid chromatography）,液-液层析（,liquid-liquid chromatography）,2.按层析过程的机制可分为,.吸附层析,(,adsorption chromatography,),-,利用吸附剂对不同组分,吸附,能力的不同,加以分离的方法。,.分配层析,(,partition chromatography,),-,利用不同组分在流动相和固定相中的,分配系数,不同而进行分离的方法。,.离子交换层析,（,ion-exchange chromatography,）,-利用离子交换剂与各组分之间的,离子亲和 力不同,而进行层析分离的方法。,.凝胶层析,（,gel chromatography,）,-利用不同组分之间,分子大小不同,，在通过凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进行分离的方法。,.亲和层析,（,affinity chromatography,）,-利用生物大分子之间特有,亲和力的不同,进分离纯化的方法。,3.按操作技术形式分类,.柱层析,（,colum chromatography,）,-将固定相装在,层析柱,中，使样品 朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。,纸层析,（,paper chrmatography,）,-用,纸,作为液体的载体，样品点在,纸上随后展开达到分离鉴定的,方法。,.薄层层析,（,thin layper chromatography,）,-将适当的,吸附剂,在玻璃板或,其他材料薄板上,铺成薄层,，样品,点在上面随后用流动相展开达,到分离鉴定的方法。,三.层析的一般原理,1.分配系数,(Partition chromatography),混合物在层析过程中不管层析技术采用哪两种状态的相(流动相和固定相)都能达到,分配平衡,，用来叙述,一种物质在两种特定相中的分配程度,是用分配系数表示的。,分配系数,-是一种物质在两种特定相中分配，在,特定的温度时,这个系数的值是一个,常数,，即:,溶质在固定相中的浓度,Cs,K=,溶质在流动相中的浓度,Cm,有效分配系数,：定义为化合物在一个相的总量除以另一个相中的总量。实际上是分配系数乘以两个相的体积比。,在不同的层析机制中,分配系数,K,的含义不同,在吸附层析中,K,为吸附平衡常数,;,在分配层析中,K,为分配系数,;,在离子交换层析中,K,为交换常数,.,分配系数,K,值大,说明物质在层析中被固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液中后出峰。若分配系数,K,值小，则该物质在洗脱液中较早出峰。,从一个混合物中分离和纯化一种生物物质的纯度如何，取决于混合物中各组分,K,值的差异程度。,混合物中各组分若,K,值相差较大,则能,较易,地把混合物中的生物物质,分离,。反之,K,值相差较小,不易,把混合物中的生物物质,分离,。,2.讨论层析中的移动情况,通常采用平衡过程的研究方法,把层析柱划分为若干连续部分,每个体系都达到平衡。,理论板数,(n),：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。,凝胶层析,Gel Chromatography,一、定义,凝胶层析,是按照,被分离物质分子大小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离的一种方法。其又称为凝胶过滤或,分子筛过滤,或排阻层析。,主要机理是,分子筛效应,当被分离物质流经凝胶柱时,因各组份的,分子大小不同,在凝胶受到的,阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的,迁移速度不同,得到分,离。,二.基本原理,流动相（洗脱液）,固定相（凝胶）,原理,：被分离物质中各组分的,分子量不同,。,进入具有一定孔径的凝胶柱后,较,大,的分子,不能进入凝胶孔隙,中,被排阻在外,而较,小,的分子则,能进入凝胶孔隙,加入洗脱剂后,大分子,就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来,受到的,阻力小,其,流速较快,小分子,物质从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中,这样,多次反复,大分子物质先从柱中流出,小分子物质后流出,。,小分子,由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而,被滞留,大分子,被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间,迅速通过,。,凝胶层析过程的数理关系,柱床体积(,V,T,),即凝胶体积以及颗粒,内外间隙体积的总和。,V,T,=1/4,D,2,h,D,是内壁的直径,h,是凝胶层析柱床的高度。,洗脱体积（,Ve,）,即欲分离物质通过层析,柱洗脱下来所需洗脱液,的总体积。,外水体积（,V,0,）,即存在于柱床内凝胶外,面空隙之间的水相体积，,相应于一般层析法中流,动相的体积。,内水体积（）,即凝胶颗粒内部所含,水相的体积，它可从,干凝胶颗粒重量和吸,水重量求得。,凝胶干体积（）,+,洗脱体积与及之间的关系,（）,为样品组分的分配系数，也可以说,是,分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。,它只与,被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布,有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数与柱的物理条件无关。,可通过实验求得。,Ve,为实际测得洗脱体积,。,Vo,可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察如,Hb,、,印度黑墨水）通过实际测量求出.,Vi,可由,g,Wr,求得（,g,为干凝胶重,单位为克,Wr,为凝胶的吸水量以,ml/g,表示）。,Ve,-Vo,Kd,=,Vi,（1）,Kd,=0,时,Ve,=Vo,意味着该分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相分布为0,而,最先流出,。,（2）当,Kd,=1,时,Ve,=Vo+Vi,意味着该分子完全不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的比值为1,而,最后流出.,（3）当,0,Kd,1,现象说明凝胶对组分有吸附作用,此时,Ve,Vo+Vi,例如一些,芳香族化合物,的洗脱体积远远超出理论计算的最大值,这些化合物的,Kd,1,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。,因此分子的正常,Kd,值,01,之间,这种由小到大的,Kd,值顺序决定了物质流出的顺序,。,Ve,与,MW,的关系,对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(,MW),大小顺序流出,MW,大的走在前面,Ve,与,MW,的关系可用下式表示:,Ve,=K1-K2lgMW,K1 K2,为常数,MW,为分子量,三.凝胶层析的特点,（一）优点,1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体。其结,构稳定,所以凝胶,本身不与样品发生化,学反应。,2.凝胶层析的,操作条件较温和,不易引起生,物物质的变性,即使用来分离一些理化性,质不稳定的物质也很少被破坏。,3.,样品得率高,重复性好,.如果按比例扩大柱,的体积和高度,可进行大量样品的分离纯,化。,（二）缺点,1.,要求,样品和洗脱液的,粘度很低,。,2.凝胶颗粒网络,孔径大小非常有限,所以可被,纯化的物质的,分子量范围受到限制,。,3.凝胶结构,对某些溶质分子具有吸附作用,如,芳香族化合物与脂蛋白等。,四.凝胶的结构与性能,1.葡聚糖凝胶,（商品名为,Sephadex,）,结构：,葡聚糖用交联剂1-氯代-2,3-环丙烷使葡聚糖之间通过醚键,(C-O-CH,2,-CH-CH2-O-),交联,聚合而成的,三维空间网状结构,。,OH,特点：,Sephadex,的三维空间网状结构的网孔大小取决于交联度,交联度的大小可在合成,Sephadex,时控制加入交联剂的百分比决定.,交联剂的百分比高,交联度大,网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械强度高,分离物质的分子量也小。,反之,交联剂的百分比低,分离物质的分子量大。,G,类,Sephadex,的型号表示,每克干凝胶吸水量,x10,如,G-50,表示每克干凝胶吸水量为5,ml。,Sephadex,的,化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱,耐热耐碱不耐酸,。,2.琼脂糖凝胶,（商品名为,Sepharose,),它是一种,大孔凝胶,其工作范围的下限几乎是,Sephadex,的上限,可分离,MW40,万以上,的物质,因此可用来分离核酸及病毒。,琼脂糖凝胶不带电荷,不受微生物作用而降解,但对热不稳定,易受,pH,影响,(,只在,pH4.5-9.0,范围内稳定,.,3.,聚丙烯酰胺凝胶,使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似,但化学性质较葡聚糖稳定,可在,pH2-11,范围内使用,.,聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶,P,（,Bio-Gel P,），由美国,Bio-Rod,厂生产，型号很多，从,P-2,至,P-300,共,10,种，,P,后面的数字再乘,1000,就相当于该凝胶的排阻限度。,4.,凝胶的选择,选择何种凝胶以及它的型号,这需要根据实验条件,溶质的分子量的大小和分离工作的目的而定,每种型号凝胶都有一定分离溶质分子量的范围,选择的型号凝胶要能满足实验要求。,六.其它条件选择,1.柱的选择,层析的长度（,L）,与直径（,D）,之比（,L/D）,对层析分辨率有影响,一般对用于,组别分离,的层析柱其,L/D,为1518：1,层析柱的体积一般大于样品体积的410倍,这类常用于脱盐.对于,分级分离,可采用,L/D 40：1,甚至,100：1,层析柱体积一般大于样品体积的25倍。,柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。,2.样品的选择：,量适当,粘度小,。,3.洗脱液的选择：,每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据,使样品稳定,的原则使用。,七.应用,1.分离纯化,2.脱盐,3.高分子溶液的浓缩,4.测分子量,凝胶层析法分离蛋白质,原理,血红蛋白（,Hb,，,分子量,64 480,左右）与二硝基苯,鱼精蛋白（,DNP,鱼精蛋白，分子量,2 00012 000,）混合物，由于分子大小不同，通过,Sephadex,G50,层析受阻滞程度有差异，从而达到分离。,器材,层析柱（,1.5,25,ml,）,等,试剂,1.,样品液：,DNP-,鱼精蛋白、,Hb,2.Sephadex,G-50,操作,1.,装柱：,在层析柱的底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的,1/3,时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的,Sephadex,G-50,悬液，待底部凝胶沉积,12,cm,时，再打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约,3,cm,即可。,装柱注意点：,不得有气泡和分层,；,凝胶表面应平整,；,柱床体积稳定；,不能让凝胶表面露出水面。,2.,加样：取样品液,5,滴即为上柱样品。将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面，注意尽量,不要使平整的床表面搅动,，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用上法不断加蒸馏水洗涤,，,立即用试管收集，待红色流尽，换试管收集。,3.,观察实验现象，并计算,Hb,的洗脱体积（,Ve,）和,DNP,-,鱼精蛋白的,Ve,。,4.,再生 用蒸馏水洗涤凝胶层析柱,1,0,分钟，此柱即可再生。,把菊根粉或白垩粉（,CaCO,3,）,装在玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。随着淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。,茨维特,在当时的实验中观察到,6,个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素,A,和,B,。,提取液,色带,Chromatographic column,Stationary phase,Mobile phase or,eluent,The mobile(top)and stationary(bottom)phases in,column,chromatography.,Paper,chromatography is an analytical method.,Note the very small sample volume spotted onto,the plate.,