电镜超薄切片.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,透射电子显微镜生物制品制备技术,组织学与胚胎学教研室：苏衍萍,冷冻蚀刻法,超薄切片,冷冻蚀刻法 冷冻割断术,细胞化学法,免疫组织化学技术 免疫电镜法,电镜放射自显影术 放射自显影技术,扫描电镜技术,被吞噬的红细胞,现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：,一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；,另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、细胞化学法、免疫电镜法、放射自显影技术、,X,线微区分析技术等。,1、,超薄切片样品的制备,（1）,取材 基本要求是在活体情况下进行,取材的原则,(,快、准、轻、小、冷的原则）,1）,快速：1分钟之内投入固定液。,2）,块小：0.5-1,mm,3,或截面1,mm,2,的长条。,3）,部位准,4）,损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。,5）,低温：0-4,o,C,取材的方法,1）动物材料：,对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。,胚胎干细胞的研究,2）培养细胞：生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000,rpm,低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4,o,C,固定、待用。,3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定,处理后再离心成团，,在50,o,C,中弃去上清液，,加入适量的经50,o,C,预温的2%的琼浆，,使团悬浮，将悬浮团,和琼脂液一同在薄片,上展层，固定后,切成1,mm3,的小块。,（2）固定,固定的目地是把细胞在活体状态时的结构尽可能完整的保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或外界微生物的侵入而产生腐败，致细胞的超微结构破坏。,1）固定液的作用,A,阻止细胞自溶。,B,稳定细胞物质成分。,C,在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。,D,能提供一定的电子反差,理想的固定剂，应具备以下条件：能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。,2,）影响固定效果的因素,固定液的酸碱度,(,pH,值,),固定液的,pH,值,渗透压,缓冲液的类型,固定的温度和时间,当前采用的是在,0,4,下固定,1,4,小时。,3）常用的几种固定剂,A,四氧化锇（,osmium tetroxide,OsO4）,亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1,g,包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内径相配制。,优点对蛋白质和脂类固定较好。对作为细胞骨架的磷酸脂蛋白的作用好，对核蛋白保护作用很好，因为在有机体内核酸和碳水化合物与蛋白制成复合的形式，因此锇酸几乎和所有的细胞成分结合。分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。,缺点不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。扩散慢，穿透能力差。具有挥发性和粘膜毒性。不适于进行细胞化学工作。,B,戊二醛（,glutaraldehyde,C5H8O2）,纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。,优点(1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。,C,甲醛（,fomaldehyde,）:,多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。,2）固定的方法,A,单固定法：对单细胞或固定液易于浸透的组织，一般单独用1-2%四氧化锇固定液固定1-2小时可达到固定的目地。,B,双固定法：戊二醛（2.5%4,o,C,2h）-,锇酸（1%4,o,C,2h）。,C,原位固定和灌注固定：将动物麻醉、解剖进行原位固定。灌注固定：通过血液循环将醛类的固定液灌流到所需组织中。神经组织、视网膜、肾脏。,附 几种常见固定剂的配制,固定液的,PH,值6.0-8.0，常用,PH,值7.2-7.4,对含水较多的组织可用,PH,值8.0，细菌、病毒可用,PH,值在7.0以下。,0.,2,mol/L,磷酸缓冲液的配制,磷酸二氢钠（,NaH2PO4.H2O）2.6g,磷酸氢二钠（,Na2HPO4.12H2O）29g,重蒸水 加到500,ml,调,PH,到7.4,0.2,mol/L,二甲坤酸盐酸缓冲液,重蒸水 25,ml,二甲坤酸钠（,Na(CH3)2AsO2.3H2O）2.14g,0.,1mol/L,盐酸 8,ml,重蒸水 加至50,ml,调,PH,到7.4,B,固定液的配制,锇酸固定液的配制,2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿-1,G,锇酸+50,ml,双蒸水（棕色瓶）数日可用。,0.1,mol/L,磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。,2%的锇酸缓冲液 10,ml 0.2mol/L,缓冲液 10,ml,调节,PH,应为7.3-7.4,戊二醛固定液的配制,25%戊二醛（,ml）0.4 1 1.6,重蒸水（,ml）4.6 4 3.4,0.2ml/L,缓冲液（,ml）5 5 5,戊二醛最终浓度 1 2.5 4,调节固定液,PH,值到7.3-7.4,（3）,脱水,1）,清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟,2）,脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。,脱水程序如下表,浓度,50%,70%,90%,100%,时间,10-15,10-15,10-15,3次（每次10-15）,温度,4,o,C,4,o,C,转室温,室温,经验：,脱水剂临时配制。,浓度梯度上升。,脱水时间和浓度。,脱水时的连续性。,脱水剂的选择,。,（4）浸透：其目的是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。,脱水和包埋剂的比例,2:1,1:2,纯包埋剂,时间,1-2,h,2-3,h,2,h,温度,室温,室温,37,o,C,温箱,经验：,浸透时间。,浸透温度,。,（5）,包埋：,目的,:,包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。,包埋剂的性质,:,粘度适中，有良好的切割性能。能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。透明度好。对人无害。,包埋剂的种类,环氧树脂类：目前国内使用较多的环氧树脂有进口的,Epon,812,和国产的,618,。,原理,:,环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。,这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。,低粘度包埋剂,(,Spurr,),为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。,水溶性包埋剂：,是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。,原理,:,水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。,包埋剂,:,DurcuPan,、乙二醇甲基丙烯酸脂,(,简称,GMA),、聚乙二醇、,Aquon,等,所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（,DDSA）,和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（,MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（,DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（,DMP30）。,1）,环氧树脂的性能和配制：,618树脂 5,ml,十二烯基丁二酸酐,DSA（,固化剂）5,ml,苯二甲酸二丁酯,DBP（,增塑剂）0.3,ml,2,4.6,三苯酚 称,DMP30（,加速剂）0.1,ml,60oC,烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37,o,C,温箱中使气泡,逸出。,Epon812,的配制,A,液：,Epon812 62ml,DDSA(,固化剂)100,ml,B,液：,Epon812 100ml,MNA(,固化剂)89,ml,A,液和,B,液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%,DMP-30(,加速剂)即可。,A,液和,B,液的比例：冬季2：8。夏季1：9。,B,液可以增加包埋块的硬度。,1）,包埋的方法,常规包埋,将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。,把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。,不加盖，37,o,C,过夜，这也就是纯包埋剂浸透。,次日，升温到60,o,C48,小时固化。,固化完毕，关温箱，自然冷却。,去掉外壳，取出组织包埋块,将组织包埋块，存放在干燥器中。,定向包埋：,注意事项,防潮、干燥。包埋剂要充分混匀。防气泡。包埋后立即清洗器皿。自身保护。干燥器中存放包埋块。,（6）切片,1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3,mm，,目数为200-300,2）,支持膜的制备：,福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的 0.2%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（,formrar,）。,注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。,火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。,帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。,碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。,复合膜：有机膜上喷镀5-10,nm,的碳膜。,微孔支持膜：高分辨率观察使用。,2）,包埋块修整：修成四面锥体（45,o,C,角）,5）超薄切片机的构造,6）切片操作,7）,切片厚度:,灰色 40-50,nm,银灰色 50-70,nm,金黄色 70-90,nm,紫色 90,nm,以上,(7)染色,1）,常用的电子染色剂,醋酸铀(,UO,2,(CH,3,COO),2,.2H,2,O：,特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。,广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。,常用浓度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。,染的时间：组织块染色时间为1-2,h,或过夜。片染30,min,即可。,枸橼酸铅（,lead acetate）：,特点：毒性大。与空气中的二氧化碳结合形成白色的碳酸铅沉淀。高,PH（11-12）,染色效果好。,也是目前最广泛使用的染色液。它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛的亲和性，能提高细胞膜系统及酯类的反差。,枸橼酸铅（,lead citrate）,溶液的配制,硝酸铅,Pb(NO,3,)2 1.33g,枸橼酸钠,Na,3,(C6H,6,O,7,).2H,2,O 1.76g,双蒸水 30,ml,混合后振荡30,min,呈乳白色，加1.0,mol/L,新鲜配制的,NaOH8ml,双蒸水 加至50,ml,调,PH,到12,2）,染色方法,A、,手工染色,单染色：用一种染色液；一般材料铅染好，免疫组化铀染好。,双染色：先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染色。,块染色：锇酸固定后，脱水前用50%-70%的乙醇醋酸铀染液染色20-30,min，,也可在脱水过程中放入含1%-2%的醋酸双氧铀的70%乙醇染液染2-10,h（4,o,C,冰箱）这样可以省去切片后的铀染过程。,B,自动染色：自动染色使用事先制好的，已商品化的醋酸铀和柠檬酸铅，在自动染色仪内进行电镜常规染色。,