定量PCR方法及数据分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,定量,PCR,原理、应用及数据分析,ZJW,原理：,PCR,（多聚酶链式反应,),：一种体外扩增特异,DNA,片段的技术。反应分为,变性,（,denaturation,）、,退火,（,annealing,）、,延伸,（,extension,）三步。,PCR,扩增理论方程：,起点定量与终点定量：,起点的,DNA,量为,“,天然,”,的含量，更有意义；终点的,DNA,量为经过,PCR,过程,“,加工,”,的量，存在部分,“,失真,”,。（终点定量存在更大的误差）,定量,PCR,：,通过实时监测,PCR,每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析,化学原理：,荧光染料嵌合法,探针法,SYBR Green I,（不饱和型），,Eva Green/LC Green,（饱和型），与,dsDNA,小沟部位嵌合，具有绿色激发波长。游离时不发光。,缺点：需用,melting curve,检测产物特异性。,探针法：,可用于多重,PCR,及基因分型,TaqMan,探针：,检测积累荧光,一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则在,3,末端。,Taqman,探针识别并结合特定的靶序列；,探针完整时，报告基团,R,发出的荧光被淬灭基团,Q,吸收；,在进行延伸反应时,Taq,聚合酶的,5,外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。,基线：,扩增曲线中的水平部分,阈值（,Threshold):,指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。,Ct,值：,从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数,定量,PCR,数学原理,定量,PCR,技术的应用,定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、,SNP,分析等、基因突变分析等,绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分析等,相对定量：,mRNA,表达分析，,siRNA,表达分析等,定量,PCR,实验流程,目标基因的查找、比对,引物、探针的设计与合成,反应体系和条件的优化,数据分析,定量,PCR,引物设计的要求：,Tm=55-65,GC=30-80%,PCR,扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在,80-300bp,之间都可。,引物的退火温度要高，一般要在,60,以上。,内参基因的选择：,内参：,用于去除不同样本在,RNA,的产量、质量以及逆转录效率差异对目标基因表达的影响。,稳定表达于不同类型的组织和细胞中（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异；,高度或中度表达，排除太高或太低表达；,表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不受任何外源性和内源性因素的影响。,常见几种内参基因的优缺点：,GAPDH,：,在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌）中表达升高，在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的不同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异；,-actin,：,细胞恶性转化时表达水平增加；,18S rRNA:,rRNA,合成的调节独立于,mRNA,。,rRNA,不包括,Poly A,尾，在以,Oligo dT,作为引物的,cDNA,合成中不能被转录。,rRNA,高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参基因稳定，且受,RNA,降解的影响比较小。,反应体系的配制,（,25ul,体系）,组分,加量,模板,cDNA,2uL,10uM,引物,F/R,各,0.5uL,2x SYBR Green mix,12.5uL,ddH2O,9.5uL,熔解曲线,绝对定量：,从荧光强度到拷贝数,相对定量的数据分析,(2,-,Ct,法,/comparative Ct method),Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.,目标基因表达量（处理组,/,非处理组）的差异,Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.,Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.,Livak,K.J et al.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)Method.,Thanks!,