液相色谱技术Chromatography课件_94页.ppt

*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,22,液相色谱技术,Chromatography,背景,色谱法也称色层法，是,1906,年俄国植物学家,Michael,Tswett,发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（,Chromatography),。,后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。,英国生物学家,Martin,和,Synge,。,他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。,1944,年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱,（,HPLC,）,等。,色谱法的基本原理,色谱法是利用混合物中各组分,物理化学,性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,慢,中等,快,色谱分离,Temporal,course,淋洗液,22.1,色谱的基本概念,固定相,：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。,流动相,：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。,分配系数,可由,Langmuir,方程得出,K,d,-,分配系数,q,、,c,-,溶质在固相和液相中的浓度,保留时间,（,t,R,）,和保留体积（,V,R,）,反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。,分离度,:,又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。,两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值,.,阻滞因子,R,f,阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相,K,d,=0,）,的迁移率之比,其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,.,洗脱体积,色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积,不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。,理论板，理论板当量高度（,HETP,），理论塔板数（,N,）、,反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。,理论板：,将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段,。,理论板当量高度：,该段色谱柱的高度。,理论板数的计算方法,N,-,理论塔板数,t,R,-,保留时间,W,1/2,-,半峰宽,W,b,-,峰底宽度,理论塔板高度：,L,-,柱长,22.2,色谱分离方法的分类,色谱分离方法很多，种类有四、五十种,但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：,按操作形式不同分类：,柱色谱,：,将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。,纸色谱,：,用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。,薄层色谱,：,将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。,纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。,按分离的压力,高压色谱,中压色谱,低压色谱,按流动相分,气相色谱,液相色谱,超临界流体色谱,22.3,各类色谱技术及应用,凝胶过滤色谱,离子交换色谱,疏水色谱,聚焦色谱,反相色谱,超临界流体色谱,羟基磷灰石色谱,灌注色谱,应用,凝胶过滤技术,1),Gel filtration chromatography(GFC,),原理,操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子,(a),，,小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外,，,加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻,。,这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。,分子筛色谱,:,从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。,分子筛凝胶色谱原理,分离关系：组分,0,的,M,最大，不能进入,gel,，洗脱体积为空隙体积,V,0,；组分,t,的,M,最小，能进入到,gel,的细孔中，其洗脱体积接近柱体积,V,t,组分,1-2,在,V,0,-V,t,之间,.,显然，,GFC,能分离洗脱体积在,V,0,-V,t,之间的组分。对于组分,1,和,2,，两峰距离,分配系数,m,影响因素,：,分子量,分子形状,gel,孔径结构；与,pH,I,T,无关,.,2),凝胶介质,对介质的要求：,1,st,亲水性高；,2,nd,表面惰性，不发生化学和物理变化；,3,rd,高稳定性，有较宽的,pH,和,I,适应范围；,4,th,具有一定的孔径分布；,5,th,机械强度高，耐高压操作，寿命长。,商品化的介质均能满足,1-4,条的要求,。,介质的类型：,1,st,Sephadex,2,nd,Sephacryl,3,rd,Superose/-dex,Sepharose,4,th,Cellulose,5,th,TSKgel,凝胶介质特征参数,排阻极限,(exclusion limit),：,指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的,M,。,如，,Sephadex,G50,的排阻极限为,30kD,。,分级范围,(fractionation range),：,能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如，,Sephadex,G50,的,分级在,1.5-30KD,内。,溶胀率,/,吸水率：,如，,Sephadex,G50,的,溶胀率,=500,30%,。,凝胶粒径：软,gel,粒径较大，在,50-150,m,之间；硬,gel,较小，在,5-50m,之间。粒径越小，,HETP,越小，分离效率越高。,床体积,(bed volume),：,1g,干燥,gel,溶胀后所占有的体积。如，,Sephadex,G50,的,床体积为,9-11 cm,3,/g,干胶。,空隙体积,(void volume),：,凝胶之间的空隙体积，即,V,0,。,空隙体积一般用平均分子量在,2000KD,水溶性蓝葡聚糖,(blue,dextran,),测定,。,4),影响,GFC,分离特性的因素,线速度：,1,st,HW40F,凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的,m=0,，故,HETP,=2,D,z,/,u,(,D,z,ud,p,)=,常数。,2,nd,HW55F,凝胶的排阻极限较大，在此，,m 0,HETP u;,在,u=0,处，直线交于点,2,D,z,/,u,。,3,rd,当,u 0.2 cm/min,NaCl,的,HETP,随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。,进样体积：,1,st,在一定相对料液体积范围内，,HETP,为常数；,2,nd,但一定时间之后，,HETP,随,料液相对体积的增加而急剧增大。,3,rd,意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的,m,差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。,料液浓度,依据,GFC,的原理，,t,r,和,HETP,与,浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使,HETP,极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在,2,以内。,分子量,M,和,分配系数,m,1,st,在,GFC,分级范围内,m,与,M,关系,此时，分离度方程为,方程示：,b,值越大，即凝胶分级范围越小，,R,s,越大。,2,nd,因此，一定料液时，根据组分的,M,选择分级范围较小的介质，提高,R,s,和料液的处理量。,凝胶的粒径,1,st,d,p,HETP.,故,d,p,是,N,的最佳途径；,2,nd,d,p,10,倍,而,h,和,v,不变，,u,10,倍，,HETP(=,hd,p,)10,倍，,R,10,倍,5,）应用,1,st,分离纯化,M,：,x0-10,6,，,d:0.x-x00nm,之间；,种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒,(50-400nm),。,2,nd,除热原、过敏原,如青霉噻唑蛋白,Sephadex,G25,凝胶柱。,3,rd,脱盐,/,置换,buffer,4,th,M,测定,原理：,挑选标准蛋白质：,cyt,C(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白,(23200),卵白蛋白,(45000),和,Hb(64500).,条件：在凝胶介质分级范围内,.,作图：,6,）优点,1,st,如其他色谱相比，操作简便，介质价廉易得；适合于大规模生产；,2nd,溶质和介质不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近,100%,；,3rd,分离结束后，无须对分离介质进行清洗和再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；,4th,作为脱盐手段，,GFC,比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。,5th,分离机理简单，操作参数少，易于放大。,7,）缺点,1st,分离仅限于分子量的差别，选择性低，处理量少；,2nd,经,GFC,洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。,离子交换色谱,以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,原理,(ion exchanger chromatography,IEC),1,st,荷电溶质在离子交换剂上的分配系数,m,I,-,离子强度；,A,和,B,为常数,均为,pH,的,函数，在物理意义上，,B,为,溶质的静电荷数与交换剂的离子价数之比,(,对于,pro,一般大于,10),。,m,-,离子强度无限大时的溶质分配系数,为静电作用外的非特异性吸附引起的溶质在交换剂上分配。,2,nd,意义：,对于,pro.,和,aa,调节,I,value,调节,|pH,pI,|value,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型,DEAE-,Sephadex,A-25,，,QAE-,Sephadex,A-25,，,CM-,Sephadex,C-25,，,SP-,Sephadex,C-25,纤维素系列离子交换剂,DEAE-Sephacel,Cellex,系列,琼脂糖系列离子交换剂,Sepharose,系列,Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow,Bio-Gel A,系列交联琼脂糖离子交换剂,Source,系列离子交换剂,特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低,阳离子交换树脂,S,系列,阴离子交换树脂,Q,系列,MonoBeads,系列离子交换剂（,Pharmacia,）,特点：介质为亲水性聚醚，具有和,Source,系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。,同样分为,Q,系列和,P,系列,Mini Q PC 3.2/3:Glutathione,synthetase,SDS-PAGE,Starting material,Peak 2,操作,1,st,恒定洗脱,(,Sephadex,常用,),缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽,2,nd,线性梯度洗脱,(linear gradient elution),线性梯度洗脱的优缺点,优点：流动相,I/pH,连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；,缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如,梯度混合器,。,3 rd,阶梯洗脱法,(stepwise elution),优点,：无须特殊设备，操作简单；,缺点,：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。,线性洗脱时间,定义：,GH,dI/dV,-,离子强度梯度,(mol/l),，,F-,流动相流量,(l/s).,利用,GH,和,I,p,关系图及上述方程，可算,t,r,分离度和柱效,1,st,分离度,意义,：,4,因素可控制,2,nd,柱效,意义：,I+dI,I,m,i,富集效应,应用：,疏水性吸附色谱,(,hydrophobic interaction chromatography,HIC),原理,1),吸附,1,st,pro,疏水性,2,nd,pro,稀疏水性差异,3,rd,原有吸附介质的亲水性,4,th,亲水性介质的改造,2),影响,pro,水化层因素,1,st,水化层,(hydration shell),tight hydration shell(0.35g water/1g pro),loose hydration shell(2g water/1g pro),2,nd,ionic strength,3,rd,|pH,水,pI|Value,|pH,水,pI|Value,zeta,电势,水化层,4,th,增加亲水性物质,离子：,SCN,-,，,ClO,4,-,，,I,-,有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质,5,th,表面活性剂,Tight hydration shell,Protein core,Loose hydration shell,洗脱方法,?,3),、,洗脱方法,降低离子强度,增加,|pH,pI,|,乙二醇,or I,-,表面活性剂,4),、富集效应,I+dI,I,m,i,分离效率和柱效,1,st,分离效率,2,nd,柱效,3,rd,降低颗粒大小的极端重要性,Applications,特点：,1,st,互补工具：,HIC,主要用于蛋白质类分离纯化，虽然,HIC,不如,IEC,的应用广泛，但可以作为,IEC,的互补工具。如方法得当，,HIC,与,IEC,的分离效率相当。,2,nd,与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此,HIC,可直接分离盐析后的蛋白质溶液。,3,rd,可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。,4,th,疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。,反相色谱,reversed phase chromatography,RPC,固定相：,非极性的反相介质，即为疏水性介质,(R1,R2,多为甲基，,R,为,C4,，,C8,，,C18,烷基或苯基，其中,C18,硅烷化制备的试剂最多，统称为,ODS,Octadecyl,silica),。,烷基化密度：,45%,，,55%,的羟基用,三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全,非极性化。,溶质在介质上的分配系数处决于溶质的疏水性，疏水性大，,m,高。,流动相：,极性有机溶剂的水溶液,(,甲醇,乙晴,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,等,),洗脱：,有机溶剂,增加。,30,m,15,m,5,m,Influence of Particle Size on the Separation effect,Source RPC,应用：,主要应用于,5000KD,以下，特别是,1000,以下的非极性小分子物质的分离,蛋白质：可以应用，但存在变性的危险。,有机溶剂,亲和色谱,（,Affinity chromatography,）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,生物亲和作用和亲和纯化技术,生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。,利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术,亲和纯化技术的发展,亲和层析,1951,年，,Campbell,等，半抗原修饰纤维素制备了生物亲和介质从血情中纯化了抗体。,1967,年，,Axen,等利用溴化腈活化琼脂糖凝胶成功制备了亲和吸附介质，使亲和层析技术从研究走向实用。,其他新型亲和技术：亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀，亲和电泳等,生物亲和作用,-,本质,亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚,蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙,-,锁关系,亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用,亲和作用中的相互作用力,静电作用,氢键,疏水性相互作用,配位键,弱共价键,影响亲和作用的因素,离子强度,pH,抑制氢键形成的物质,温度,螯合剂,亲和作用体系,特异性,亲和体系,高特异性,酶,-,底物、产物、抑制剂,抗原,-,单克隆抗体,荷尔蒙,-,受体蛋白,核酸,-,互补碱基链段,群特异性,免疫球蛋白,-A,蛋白、,G,蛋白,酶,-,辅酶,酶、蛋白质,-,过渡金属离子（,Cu,2+,Zn,2+,),凝集素,-,糖、糖蛋白、细胞表面受体,配基（,ligand,),：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。,L+E,E,L,解离常数：,K,d,=EL/EL,结合常数：,K,a,=1/Kd=EL/EL,亲和体系的结合常数为,10,4,-10,8,dm,3,/mol,亲和层析原理,亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法,亲和层析,-,操作过程,亲和配基,酶的抑制剂,:,大豆胰蛋白酶抑制剂,抗体：抗体,-,抗原，,Ka=10,7,-10,12,。单抗免疫亲和层析,A,蛋白：与免疫球蛋白,IgG,结合。,凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。,辅酶和磷酸腺苷：辅酶,I,，与脱氢酶，激酶结合。,三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。,Reactive Blue 2,与脱氢酶，激酶结合。,过渡金属离子,:Cu2+,Ni2+,Zn2+,组氨酸,:,咪唑环，静电和疏水作用。,肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。,亲和吸附介质,将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质,具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；,物理和化学稳定性高，有较高的机械强度,含有可活化的反应基团,粒径均一的球形粒子,亲和配基固定化,亲和配基的固定化方法,介质的活化,溴化腈活化法：,-NH,2,，,在碱性条件下完成。,环氧基活化法：,-NH,2,-OH,-SH,直接固定法和间接固定法（氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法）,硅胶的活化法,:-OH,，不宜在碱性条件下进行。,间隔臂的作用,当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”,间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱,过程及影响,因素,过程,：,进料,清洗,洗脱,柱子再生。,应,保证配基对目标产物有较高的吸附容量。,目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用,Freundlich,或,Langmuir,型的等温式表示。,进料过程中的杂质影响,料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。,进料的料液流速,流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。,目标产物洗脱,特异性洗脱,洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物,例：精氨酸溶液洗脱赖氨酸为配基亲和吸附的,t,-PA,目标产物洗脱,非特异性洗脱：调节洗脱液的,pH,值，离子强度，离子种类或温度等理化性质。,柱子：,BSA-,Sepharose,4B,洗脱方式：逐次降低洗脱液,pH,值,分离组分：,BSA,血清不同的抗体组分。,应用举例,组织纤溶酶原激活剂（,t,-PA,）的纯化,干扰素（,IFN,）的纯化,重组人白细胞干扰素，经一步单抗免疫亲和层析，,rhIFN-,比活提高了,1150,倍，收率达,95%,。,柱子：精氨酸,-,Sepharose,4B,亲和柱,洗脱液：盐酸胍（,GuCl,),猪心组织,t-PA:,活性提高,7,倍，收率为,56%,22.4,蛋白质分离常用的色谱方法,免疫亲和色谱,属于吸附色谱中的一种，利用抗原,-,抗体作用的高度专一性以及较强的吸附力，实现特殊蛋白质的分离,免疫亲和色谱介质的获得：,（,1,）获得抗体,（,2,）抗体连接到载体上,疏水色谱,在载体表面连接上疏水的直链碳链或其他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的某些疏水基团相互作用，从而实现多组分的分离。,操作要点,蛋白质的局部变性,洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行,离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段,操作要点：,由于蛋白质是两性电解质，在不同的,pH,值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定,由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂,适当调节缓冲溶液的,pH,值，使蛋白质适当解离，通常采用的,pH,值靠近其等电点（不是等电点）,缓冲溶液的离子强度不能过高，通常在,1020m mol,。,色谱方案的确定，需要视试验情况作适当调整。,洗脱方式,：,pH,梯度,离子强度梯度,22.5,色谱系统,高通量液相色谱系统,分析型色谱系统,AKTA explorer 100,色谱系统,AKTA explorer 100,色谱系统工作流程,HPLC,HPLC,AIEX,Technique,Ultrafiltration,UF,Superdex,200,p.g,.,GF,Purificationfactor,Q,Sepharose,FF,10,times purification,82%yield,Phenyl,Sepharose,HP,HIC,Y.-F.,Liao,et al.(1996),J.Biol.Chem.271,28348,63,622,719,Purification of recombinant,a,-,mannosidase,from,Pichia,pastoris,多肽的分离纯化,蛋白的纯化,Technique,Ppt,HIC,AIEX,CIEX,AC,Purificationfactor,7,20,2408,18647,Porcine cerebella homogenate,RESOURCE Q,Ammonium,sulfate,precipitation,Butyl,Sepharose,Fast Flow,RESOURCE s,HiTrap,Heparin,G Protein Receptor,Kinase,Purification,Rec,a,-,Mannosidase,Purification from,Pichia,Technique,Purificationfactor,63,622,719,UF,GF,AIEX,HIC,Phenyl,Sepharose,HP,Q,Sepharose,FF,Superdex,200 pg,Ultrafiltration,DNA Binding Protein Purification,Technique,DNA-1,Sepharose,CIEX,AC,AC,AC,CIEX,Purificationfactor,5,8,4943,9,2447,HeLa,cell nuclearextracts,SP,Sepharose,High Performance,Heparin,Sepharose,Fast Flow,DNA-2,Sepharose,Mono S,思考题,什么是色谱分离技术？,色谱分离技术的分类？,常用的蛋白质分离方法有哪些？并简述其原理,.,什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？,什么是吸附色谱及其分类和基本原理？,什么是分配色谱？,简述高效液相色谱的工作原理？,离子交换色谱的分类及应用,凝胶色谱的分离原理及分类,离子交换及疏水作用色谱的原理,高效液相色谱的分离原理及应用？,共价色谱的工作原理？,