第章生物样品前处理.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第二章 生物样品前处理,Anhui University of Technology and Science,TeachingandResearchSection,Department of Biochemical Engineering,*,Click to edit Master text styles,Click to edit Master title style,第章生物样品前处理,第一节 样品分离的预提取,第二节 细胞的破碎与分离,第一章 绪论,2,第一节 样品分离的预提取（前处理）,前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除；,2.1.1,概述,预处理材料的种类和特点,动物细胞反应液,植物细胞反应液,微生物细胞反应液,植物组织提取液,动物组织提取液,“发酵液”“产物”，胞内,or,胞外？,组织,3,2.1.2,植物组织提取物的制备,植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。,叶片、根、茎,清洗去泥沙、灰尘等杂质（,-4C -30C,低温保存备用）；,种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等,泡涨，粉碎。,4,一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。,2.1.2.1,植物组织中酶的提取,5,例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取,1.,步骤：,100g,新鲜叶片切成小片（打孔器、切片）置入提取液中（稳定酶活性）,PVPP,预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性,PVP,聚乙烯吡咯烷酮,，）间歇高速搅拌（充分接触混匀）纱布过滤滤液加入,PVPP,重复轻搅（重复一次）离心去除,PVPP,酶粗提液。,6,2.,条件讨论,低温（,4,5,度），器皿、溶液预冷、操作要快；,5,7,倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；,，中性，未知蛋白酶要远离等电点；,PVPP,优良，不溶性；,PPO,抑制剂，,DTT,、,2-ME,；,蛋白酶抑制剂,PMSF,（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。,7,2.1.2.2,多糖提取,重要活性多糖,步骤：原料粉碎醇醚回流脱脂水提取粗提液,去蛋白策略：,Sevag,法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性,TCA,法，低浓度的,TCA,可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。,8,第一节 样品分离的预提取（前处理）,通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；,微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。,EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂,在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。,PPO抑制剂，DTT、2-ME；,原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。,X-press法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。,有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。,在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。,条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）,时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%；,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,价格高，限制了大规模应用,变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水,通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；,在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。,适用于细胞壁较脆弱的细胞、实验室规模,EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂,适用于绝大多数微生物细胞的破碎,当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,溶解包涵体：释放目的蛋白；,EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂,通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；,所以要在预处理阶段去除酚类化合物。,较小的革兰氏阳性菌（细胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不适合,细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,玻璃珠（石英砂、氧化铝等研磨剂）+细胞悬浮液研磨释放胞内物,2.1.2.3,细菌重组蛋白的提取,重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，,40%,总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。,9,例：,E.coli.,中提取重组蛋白,1.,步骤：,酶解菌体细胞：离心收集菌体溶菌酶去核酸（,DNase,）电泳检测；,清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；,溶解包涵体：释放目的蛋白；,目的蛋白再折叠：恢复活性,10,第二节 细胞的破碎与分离,微生物代谢产物：,胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）,胞内产物（大多数蛋白质、类脂）,微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组,DNA,技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,2.2.1,概述,11,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%；,在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。,适用于细胞壁较脆弱的细胞、实验室规模,细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。,价格高，限制了大规模应用,原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。,适用于绝大多数微生物细胞的破碎,TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。,产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。,胞内产物（大多数蛋白质、类脂）,时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%；,叶片、根、茎清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4C -30C低温保存备用）；,2.2.2,常用破碎方法,机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、,X-press,法等；对物料的挤压和剪切作用,非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；,12,2.2.2.1,珠磨法,原理：,进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝,dG+,酵母。,易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂,N2,、,PMSF,等,特点：,18,溶菌酶（细菌），,-3,，,3-,葡聚糖酶，,-1,，,6-,葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。,特点：,条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）,价格高，限制了大规模应用,通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定；,产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶,2.2.2.4,酶溶法,外加酶,19,将新鲜的生物材料存放于一定的,pH,和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。,特点：,对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。,自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。,自溶法,20,2.2.2.5,化学渗透法,原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。,21,表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎,EDTA,螯合剂：与结构中,ca2+,或,Mg2+,螯合，使其原有结构破坏而破裂,有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎；,变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水,22,特点,选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。,细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；,时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过,80%,；,有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。,23,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,2.2.2.6,反复冻结,融化法,原理：,24,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥,干燥法,25,X-press,法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至,-25,形成冰晶体，利用,500MPa,以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,2.2.2.8,其他方法,26,渗透压法：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,适用于细胞壁较脆弱的细胞、实验室规模,27,微波加热法：热运动使液态水气化，冲破细胞壁。,28,