第十二节抗药性及其治理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十二节 昆虫抗药性及治理,迄今至少有,500,多种昆虫及螨、,150,多种植物病原菌、,180,多种杂草生物型产生了抗药性。,了解有害生物抗药性形成的机理及抗药性治理的策略，对于正确合理地使用农药及研制新农药都有重要意义。,一、害虫抗药性的概念和定义,二、害虫抗药性的发展概况,三、我国农业害虫抗药性现状,四、害虫抗药性的形成,五、影响抗性发展的因子,六、害虫抗药性治理,一、害虫抗药性的概念和定义,1.,定义,世界卫生组织（,WHO,）：,昆虫具有耐受杀死正常种群大部分个体的药量的能力在其种群中发展起来的现象,。,Sawicki,（,萨威基,）,：,抗药性是指害虫能够降低田间防效的一种反应，这是对毒物选择作出的一种遗传上的改变。,抗药性特点,（,1,）抗药性是对有害生物群体而言的（种群性）；,（,2,）是针对某种特定的药剂而作出的反应（特定性）,（,3,）是药剂选择的结果（选择性）；,（,4,）是可以在群体中遗传的（可遗传性）；,（,5,）是相对于敏感种群或正常种群而言的（相对性）。此外，应注意不要将“抗药性”和“自然耐药性”相混淆。,2.,几个基本概念,自然耐药性,(natural resistance),：,指一种昆虫在不同发育阶段、不同生理状态及所处的环境条件的变化对药剂产生不同的耐药力。,也叫自然抗性。,交互抗性（,cross resistance,）：,昆虫的一个品系由于相同抗性机理或相似作用机理或类似化学结构，对于选择药剂以外的其他,从未使用过的,一种药剂或一类药剂也产生抗药性的现象。,负交互抗性,(negative resistance),：,指昆虫对一种杀虫剂产生抗性后，反而对另一种药剂变的,更为敏感,的现象。,一、害虫抗药性的概念和定义,多抗性,(multiple resistance),：,昆虫的一个品系由于存在多种不同的抗性基因或等位基因，能对几种或几类药剂都产生抗性。,选择性：,指不同昆虫对药剂敏感性的差异。,抗性倍数：,R,的,LD,50,（,LC,50,）,/S,的,LD,50,（,LC,50,）,一、害虫抗药性的概念和定义,对农业害虫来说，如果提高,5,倍以上，一般来说已产生了抗药性，如果是卫生害虫（蚊，蝇）其抗性倍数达,5-10,倍，认为产生了抗性。,测定抗性必须使用相同的方法才能比较，常用的方法有点滴法，浸渍法等。,抗性 抗性指数,级别 （倍数）,无抗性：,5,低抗：,5-10,中抗：,10-40,高抗：,40-160,极高抗：,160,二、害虫抗药性的发展概况,二、害虫抗药性的发展概况,二、害虫抗药性的发展概况,447,种抗性节肢动物中，,59%,是重要的农业害虫,(264,种,),，,38%,是重要的卫生害虫,(171,种,),，,3%,是寄生性或捕食性天敌,(12,种,),。,二、害虫抗药性的发展概况,三、害虫抗药性的形成,1.,抗药性的形成,昆虫对杀虫剂产生抗性的问题，实质上是一个种群遗传学的问题。,选择学说 认为抗药性是一种前适应现象（,preadaptive,phenomenon,），,完全取决于杀虫剂的选择作用。,诱导变异学说 认为昆虫种群中原来不存在抗性基因。而是由于杀虫剂的直接作用，使昆虫种群内某些个体发生突变，产生了抗性基因。药剂不是选择者而是诱导者。后适应现象。,基因重复学说：即基因复增学说,gene duplication theory,。,它与一般的选择学说不同，虽然它承认本来就有抗性基因的存在，但它认为某些因子（如杀虫剂等）引起了基因重复，即一个抗性基因拷贝为多个抗性基因，这是抗性进化中的一种普遍现象。,染色体重组学说：因染色体易位和倒位产生改变的酶或蛋白质，引起抗性的进化。,三、害虫抗药性的形成,1.,抗药性的形成,抗性的形成实际上是一种进化现象，至少包括,3,个因素：,（,1,）变异 （,2,）遗传 （,3,）选择,选择起了定向的作用，即使基因频率向一个方向发展，逐代累加。,抗性是杀虫剂选择的结果。产生抗性的原因有多种，按其由遗传引起的种群特征的变化，或形态、生理生化特性的变化，可分为行为抗性和生理生化抗性。,三、害虫抗药性的形成,2.,抗药性形成的机制,2.1,生理生化抗性,生理抗性：包括表皮和神经膜穿透作用降低，脂肪体等惰性部位贮存杀虫剂的能力增强、排泄作用增强，围食膜特别发达，或能引起呕吐、或分泌大量水分而引起水泻，加速将药剂排出体外等。,生化抗性：主要是指由解毒作用增强、代谢加速而引起的，故又称为代谢抗性。,三、害虫抗药性的形成,2.,抗药性形成的机制,简单地说，昆虫对各类杀虫剂涉及的主要生理生化抗性机理有以下几个方面：,（,1,）穿透速率降低。包括两种类型：一是杀虫剂穿透昆虫表皮的速率降低，二是杀虫剂对神经系统穿透作用降低；,（,2,）代谢抗性：涉及到的酶有，细胞色素,P450,酶系、水解酶（主要是酯酶）、谷胱甘肽转移酶、,DDT-,脱氯化氢酶等；,（,3,）靶标部位敏感度降低等。,三、害虫抗药性的形成,2.,抗药性形成的机制,2.1,生理生化抗性,Forgash,等（,1962,）首先提出，一个多抗性的家蝇品系对二嗪农的穿透率降低。狄氏剂和,DDT,在抗性家蝇中的穿透作用降低。并命名为,ORGANOTIN-r,，,其突变基因命名为,tin(,或,pen),。,表皮穿透降低实际上是穿透常数降低，即杀虫剂穿透昆虫表皮的速率降低，而延缓杀虫剂到达靶标部位的时间。在这一时期内使抗性昆虫有更多的机会来降解这这些化合物。,表皮穿透降低对杀虫剂无专一性，已报道的杀虫剂有,DDT,、,狄氏剂、对硫磷、西维因、二嗪农、马拉硫鳞、敌百虫、氯硫磷和其它杀虫剂。,2.1.1,穿透作用降低,（,1,）表皮穿透作用降低,2.1,生理生化抗性,2.1.1,穿透作用降低,（,2,）神经系统穿透作用降低,2.1,生理生化抗性,“,pen”,基因是一个修饰基因，也就是说单独起作用时，对抗性影响不大，但与其它因子，特别是各种代谢基因一起作用时，抗性就会显著加强，所以又称,pen,基因为强化基因或增效基因。,例如，在抗,DDT,的家蝇中发现，由于,MFO,活性增高，产生,50,倍的抗性，表皮穿透作用降低，产生,2,倍的抗性，那么这,2,个因子共同起作用时，其抗性水平可达,900,倍。,实际上由于研究方法的限制可能低估了穿透抗性的作用，从渗透剂的增效作用可以推测穿透抗性在某些情况下可能扮演更为重要的角色。,2.1.1,穿透作用降低,2.1,生理生化抗性,有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标乙酰胆碱酯酶,DDT,和拟除虫菊酯类杀虫剂的主要靶标钠通道,环戊二烯类杀虫剂的靶标,GABA,受体。,2.1.2,作用靶标部位敏感性降低,2.1,生理生化抗性,三、害虫抗药性的形成,2.,抗药性形成的机制,AChE,AChE,的不敏感性主要由,AchE,变构引起，而,AchE,的变构则是结构基因的点突变造成的。例如，果蝇中的,AChE,是由一个独特的位点,Ace,编码的。,Ace,中的一个,T,突变为,A,将导致,AChE,的苯丙氨酸（,368,）突变为酪氨酸后改变了,AChE,的催化特性，结果降低了对杀虫剂的敏感性。,点突变可以发生在不同的部位，从而导致不同的抗性型。从果蝇的田间品系中发现了,4,种突变型：苯丙氨酸（,115,）变为丝氨酸；异亮氨酸（,199,）变为缬氨酸或苏氨酸；甘氨酸（,303,）变为丙氨酸。,一个突变型的,AChE,中几个点突变的组合不但会导致产生不同的抗性型，而且对抗性有明显的增强作用，即高抗性有可能来自几个低抗性点突变的组合。,AChE,敏感性下降，除了,AChE,质的改变，即上述变构,AChE,外，,AChE,量的增加即,AChE,基因表达调控也可能对抗性产生,影响,。,钠通道,钠通道的改变，引起对杀虫剂敏感度下降，结果产生击倒抗性（,Knockdown resistance,，,简称,Kdr,），,包括抗性水平更高的超,Kdr,因子。,Kdr,型抗性通常具有如下的特点：,（,1,）,Kdr,基因是隐性基因，即只有在纯合子状态下才表现抗性，杂合子状态并不表现抗性；,（,2,）,Kdr,基因对,DDT,和拟除虫菊酯杀虫剂引起神经敏感度降低；,（,3,）对所有拟除虫菊酯和,DDT,都有交互抗性；,（,4,）对拟除虫菊酯产生很高的抗性，特别是在有超,Kdr,基因存在时，可产生数千倍的抗性。,Kdr,型的分子机理：,神经膜磷脂双分子层的变异；钠通道数量的改变；钠通道质的改变。,膜上的脂对膜蛋白和酶的结构与功能起重要作用，如果神经膜脂蛋白或脂类组成发生变化，或由于脂诱导而造成酶的构型发生变化，最后都会导致神经敏感性下降。,昆虫对拟除虫菊酯的毒性反应有很大差异的原因可能是由于不同昆虫的神经膜中的脂质比例不同而引起的。,钠通道数量的改变与产生击倒抗性有或无关；,钠通道,Kdr,的本质是钠通道的变异。,通过对敏感和抗性品系中位于第二染色体上的果蝇钠通道,Sch,等位基因克隆化和测序，发现位于同源结构阈,的,S5,和,S6,连接片段的一个位点发生了突变，导致敏感品系,Sch,序列中,1172,位的天冬氨酸残基在抗性品系中被天冬酰胺取代，使连接片段失去一个负电荷，此负电荷的丧失是产生,Kdr,机制的原因。,在拟除虫菊酯抗性烟草夜蛾体内是单个碱基发生了突变（,T,到,A,），,而该突变基因能将亮氨酸改变为组氨酸，从而引起钠通道蛋白改变造成击倒抗性。,Kdr,型的分子机理：,-,氨基丁酸（,GABA,）,受体,果蝇对环戊二烯类的抗性是由位于第,染色体臂的单个主要基因（,Rdl,）,控制的。在家蝇中,Rdl,基因位于第,染色体。,环戊二烯抗药性是由,GABA,A,受体,-,氯离子通道复合体上环戊二烯和木防己苦毒宁（,PTX,）,结合部位敏感度下降所致。,Ffrench,-Constant,等首先从野生型对环戊二烯类杀虫剂有高抗性的果蝇品系中克隆了环戊二烯抗性基因,Rdl,。在,Rdl,基因 中，仅发现在,302,位的丙氨酸变为丝氨酸，正是这一突变与环戊二烯,/PTX,结合部位的不敏感度有关。,昆虫在杀虫剂的选择压力下，通过增强体内解毒酶的活力和提高酶蛋白与杀虫剂分子的亲和性以及加强各种形式的酶促结合等方式，加速对进入昆虫体内的杀虫剂的解毒代谢作用而使昆虫表现出的抗药性，就是代谢抗性，简单地说就是解毒能力增强。,参与代谢作用并与抗性有关的酶系主要有细胞色素,P450,酶系、谷胱甘肽转移酶和水解酶（主要是脂族酯酶、,DDT-,脱氯化氢酶等）等。,2.1.3,代谢作用增强,2.1,生理生化抗性,三、害虫抗药性的形成,2.,抗药性形成的机制,细胞色素,P450,酶系与抗药性,细胞色素,P450,的化学本质是蛋白质，它不是一种蛋白而是分子质量在,46-60Kda,（,黄俊勇和冷欣夫，,1991,）的结构类似而又不尽相同，性质类似而又有差异的一族蛋白质（唐振华，,1990a,）。,主要包括两类细胞色素：细胞色素,P,450,和细胞色素,b,5,；,二种黄素蛋白，即,NADPH-,细胞,P450,还原酶和,NADH-,细胞色素,b,5,还原酶；还含有磷脂等。,P450,蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使,P450,酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及其它环境有毒化合物具有代谢作用，还参与一些重要的生理功能内源性物质如激素、脂肪酸的代谢，在生物体中起十分重要的作用。,细胞色素,P450,单加氧酶的功能是催化底物分子羟基化,RH+NADPH+H,+,+O,2,ROH+NADP,+,+H,2,O,上述反应需要细胞色素,P450(,Cyt,P450),参与。,细胞色素,P450,单加氧酶,(,cytochrome,P450,monooxygenase,),，又称混合功能氧化酶,(mixed-function,oxidase,),或羟化酶,(,hydroxylase,),细胞色素,P450,单加氧酶作用机制,细胞色素,P450,酶系与抗药性,P450,酶系对杀虫剂代谢作用的增强是大多数重要害虫对杀虫剂产生高水平抗性和交互抗性的主要原因（,Scott,1996,）。,其直接证据来自,MFO,的离体测定，主要是通过：,a,杀虫剂氧化代谢的直接测定；,b,模型底物氧化代谢的测定；,c,对,MFO,酶系中,P450,水平的测定；,d P450,光谱特征的变化。,研究结果表明，抗性的发展普遍与微粒体氧化作用增强有关,。,其,间接证据是通过研究一些增效剂的作用发现的。增效醚（,pbo,）是,MFO,的专一性抑制剂，并对抗性品系的增效作用大于敏感品系。利用,pbo,的增效作用来判断,MFO,是否参与害虫抗药性形成，是研究抗药性性生理生化机制的常用工具之一。,昆虫抗药性除与,MFO,中的细胞色素,P450,水平有关外，还和其他组分，特别是,P450,还原酶和细胞色素,b,5,水平有关。,MFO,解毒能力增强：,P450,量的增加，,P450,质的改变。,另外，,MFO,活性增强可能也是造成交互抗性的原因之一。,细胞色素,P450,酶系与抗药性,酯酶与昆虫抗药性,酯酶是能够水解酯键的一类水解代谢酶。,昆虫中的酯酶主要是,B,类酯酶，包括胆碱酯酶、磷酸酯酶和羧酸酯酶。与抗性有关的主要是羧酸酯酶。,羧酸酯酶实际上是由许多同功酶组成的。例如棉铃虫幼虫体内有,10,个羧酸酯酶同功酶。,羧酸酯酶解毒能力的增强在某些昆虫对有机磷杀虫剂的抗性中起重要作用，对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性中起一定的作用，而对氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性主要是,MFO,的作用，羧酸酯酶的作用很小。,酯酶活力增强主要有两个方面的原因：一是质的改变，即某一个或某一些同功酶发生了变构；二是量的改变，即酶量的增加。,酯酶量的增加又有三种途径：一是基因扩增；二是基因表达调控的改变；三是这两个途径兼而有之。,酯酶在昆虫对杀虫剂的抗药性机制中起两方面的作用：一方面是催化杀虫剂酯键断裂，代谢解毒；另一方面是作为结合蛋白和进入体内的杀虫剂结合，从而减少到达作用靶标的量。,酯酶与昆虫抗药性,谷胱甘肽转移酶（,GSTs,）,与昆虫抗药性,催化亲电子物质与内源的还原性谷胱甘肽（,GSH,）,反应（主要是将底物中的某个基团转移到,GSH,的硫原子上）的一类酶称为谷胱甘肽,S,转移酶，简称,GSTs,。,依所转移的基团种类将,GSTs,分为,5,类：烷基转移酶、芳基转移酶、芳烷基转移酶、链烯转移酶和环氧化物转移酶。,在昆虫抗性机制中主要涉及到烷基转移酶和芳基转移酶。,研究表明，,GSTs,代谢能力增强是家蝇对有机磷的抗性机制之一。如抗二嗪农的家蝇品系较敏感酶系的,GSTs,代谢强度高,5.2,倍。此外，谷胱甘肽（,GSH,）是,GSTs,催化结合反应的辅助因子，,GSH,的含量对,GSTs,的催化有很大影响。已有实验证明某些昆虫的抗性与,GSH,含量增加有关。,GSTs,结合杀虫剂后，增强了杀虫剂分子的水溶性，因此有利于被害虫排出体外，从而使杀虫剂解毒。,DDT-,脱氯化氢酶,及硝基还原酶,昆虫体内的,DDT,在,DDT-,脱氯化氢酶的作用下，将,DDT,转化为无毒的,DDE,。,DDT-,脱氯化氢酶有称为,DDT,酶，存在于各种组织，包括化感器，保护神经系统免受积累过多的,DDT,。,大量的研究表明昆虫对,DDT,的抗性程度由于,DDT,酶活性存在正相关性。,有机磷杀虫剂中有硝基结构的化合物如对硫磷、杀螟硫磷及苯硫磷等，可以被硝基还原酶代谢为无毒化合物。,总之，代谢抗性的化学本质是杀虫剂代谢活性的增强，归因于相关酶在数量或质量上的改变，可能涉及的机制包括基因扩增、酶基因突变以及基因转录的增强等。,2.,抗药性形成的机制,感觉到不安全而飞离。例如在喷洒菊酯类药剂的地方，蚊子在未接触到足够的药量前就迅速飞离，以致不能致死。,2.2,行为抗性,即昆虫受到杀虫剂的刺激而改变了习性，对药剂的敏感度增加。使昆虫,Na+,通道敏感度降低,必须指出，某一种群对某一杀虫剂的抗性，其机制往往不是单一的，即使是酶活性提高，也不一定就是某种酶活性提高，可能是几种解毒酶活性都提高的结果。,三、害虫抗药性的形成,四、影响抗性发展的因子,遗传学因子,生物学因子,操作,因子,5.1,遗传学因子,(1),原始抗性基因频率：决定抗性速度的主要因素,(2),抗性基因是显性还是隐性：一是涉及到抗性形成的速度问,题；二是涉及到抗性种群的纯度。,（,3,）抗性基因之间的相互作用：抗性若是单基因，则难以形成高抗性。二个抗性基因结合时对抗性的影响是倍增，而不是简单的相加作用。,此外，抗性基因的相对适合度、抗性基因的共适应及抗性基因在染色体上的位置等遗传学因子也对抗性的发展影响很大。,5.2,生物学因子,害虫的种类，习性，世代均影响其抗性。,（,1,）世代：卫生害虫农业害虫仓库害虫。,（,2,）活动性活动性小活动性大，迁飞的害虫,（,3,）食性：寡食性多食性,（,4,）害虫的栖息场地：栖息地少栖息场所多变,5.3,操作因子,包括人为因子，药剂的性质，使用方法，次数、浓度、剂量等。,（,1,）药剂性质：残效期短的药剂易分解，残效期长的不易分解，易造成抗药性，缓释剂残效期更长，则易产生抗药性。,（,2,）药剂的使用量、次数：高剂量、次数多的产生抗药性，它可使敏感种群被淘汰，抗性种群得以发展。,（,3,）使用范围：范围越大越易产生抗药性。,五、害虫抗药性治理,津巴布韦杀螨剂轮用治理方案,二苯基化合物类,（三氯杀螨砜等）,甲脒或氨基甲酸酯类,（双甲脒等）,有机磷类,（久效磷、三唑磷等）,2,年后,2,年后,2,年,后,（一）害虫抗药性治理的基本原则和策略,1,、基本原则,（,1,）尽可能将目标害虫种群的抗性基因频率控制在最低水平；,（,2,）注重选择没有交互抗性的药剂进行交替轮换使用和混用；,（,3,）选择最佳施药时间和方法，严格控制施药次数；,（,4,）实行综合防治；,（,5,）尽可能减少对非目标生物的影响。,2.,杀虫剂抗性治理的策略,（,1,）适度治理,(Moderation,Manag-ement,),限制药剂的使用，降低总的选择压力，而在不用药阶段，充分利用种群中抗性个体适合度低的有利条件，促使敏感个体的繁殖快于抗性个体，以降低整个种群的抗性基因频率，阻止或延缓抗性的发展。,2.,杀虫剂抗性治理的策略,（,2,）饱和治理,(Saturation Management),当抗性基因为隐性时，通过选择足以能杀死抗性杂合子的高剂量进行使用，并有敏感种群迁入起稀释作用，使种群中抗性基因频率保持在低的水平，以降低抗性的发展速率。,2.,杀虫剂抗性治理的策略,（,3,）多种攻击治理,(Multiple Attack Management),当采用不同化学类型的杀虫剂交替使用或混用时，如果它们作用于一个以上作用部位，没有交互抗性，而且其中任何一个药剂的选择压力低于抗性发展所需的选择压力时，那就可以通过多种部位的攻击来达到延缓抗性的目的。,（二）抗性监测在抗性治理中的作用,1,、设计抗性治理方案的依据,2,、评估抗性治理的实际效果,监测抗,性变化,评估治理,方案和效果,为抗性治理方案的修订补充提供依据,监测害虫发生情况,预测抗性水平及分布,抗性的,早期预警,3.,抗性监测方法,抗药性监测是指通过生物测定、解毒酶活性分析、靶标敏感性测定或分子生物学等技术，确证昆虫种群是否产生抗性，如果产生抗性，监测抗性水平和变化动态 抗性监测的技术有生物测定技术；生化检测技术；神经电生理检测技术；分子生物学检测技术。,（,1,）生物测定技术,早在,1956,年世界卫生组织,(WHO),曾组织了一系列害,虫抗药性测定方法的讨论会,并于,1970,年正式制定出标准,测定方法,.,联合国粮食和农业组织,(FAO),在,1969,1974,年,先后发表了测定原理和,15,种农业害虫抗药性测定试行方,案,.,我国根据实际情况和害虫种类,也制定了相应的害,抗药性测定方案,.,这些方案考虑的因素主要是药剂的作用,方式和昆虫的形态学。,a.,抗性倍数法（,LD,50,）,让害虫在室内条件下接触到不同剂量（浓度）梯度的杀虫剂得到剂量反应关系（,LD-P,线），计算出,LD,50,（,LC,50,）和,LD-P,线的斜率,b,，然后与敏感品系相比较计算出抗性倍数，以确定抗性的有无和程度。,b.,区分剂量（,discriminating dose,）法,使用,1,至,2,个能够区分害虫种群中抗性个体、杂合子和敏感个体的剂量进行测定，从而确定抗性个体频率。该方法使用成功与否的关键是得到合适的区分剂量，通常做法是根据敏感品系的,LD,99,或,LD,99.9,来确定，但最好通过抗性遗传分析得到区分剂量。,LD,99,：用来杀死一种昆虫群体中几乎所有敏感个体，而几乎不杀死该群体中表现型抗性个体（包括抗性杂合子和抗性纯合子个体）的某一杀虫剂的剂量。,在抗性遗传特征为完全显性或不完全显性的情况下，由于杂交,F1,（,RS,或,SR,）的毒力回归线靠近抗性亲本的毒力回归线，而与敏感亲本的毒力回归线往往不易重叠，通常就可以用敏感毒力回归线的,LD,99,作为区分剂量，用该区分剂量处理某个种群，就可以得到该种群中抗性个体百分率。,c.,单雌系,F1,代遗传监测（检测）法,Gould,等（,1997,）将区分剂量和单对杂交结合在一起提出单对,F1,法（单对杂交法）。用室内筛选出的抗性品系与田间采集的个体进行单对杂交，其杂交后代（,F1,代）幼虫在区分剂量下受试，而确定早期抗性基因频率情况。其适用条件：隐性基因控制的抗性；必须是单对基因控制的抗性；实验室内要有纯度较高的抗性品系。与常规检测技术相比，灵敏度很高，能够监测出田间早期抗性基因频率。,d.F2,代浓缩遗传法,：,Andow,等（,1998,）提出,F2,代遗传检测法检测敏感度，比区分剂量法提高,10,倍。从田间采集成虫进行单对交配，每个单对作为一个单雌系，其后代进行同胞自交，自交后初孵幼虫（,F2,代幼虫）用区分剂量（或高表达,Bt,作物）进行抗性个体的筛选。理论上，如果,F2,代的原始亲本中最初携带了一个抗性基因，在,F2,代幼虫中，约有,1/16,的个体为抗性纯合子（,rr,基因型）。初步检测到抗性个体的单雌系进行单独饲养进行,F4,代核实验证，根据携带抗性基因的单雌系数目进行评估大田害虫种群的抗性等位基因频率。此法浓缩了抗性基因，尤其适用于检测田间稀有隐性抗性基因的频率。,农药穿透生物学与抗药性测定,农药穿透生物学关于农药穿透生物体的模式与生物本身的行为学或生理学间的关系的理论。同一种药剂对于不同的生物因为其穿透模式不同由此而产生的抗性机制会存在差异。抗性的测定方法必须考虑与田间条件下药剂实际存在的穿透模式相一致的药剂处理方法才可能真是反映生物对药剂的抗药性程度及其机制。所以对于昆虫抗药性测定的标准有必要重新进行评价和制定。,（,2,）生化检测法,a.,解毒酶活性检测技术,通常采用酶标板法检测昆虫个体的酯酶、多功能氧化酶和谷胱甘肽,S-,转移酶等对各自模式底物的活性。,b.,靶标敏感性检测技术,检测乙酰胆碱对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的不敏感性，用神经电生理方法检测昆虫神经对杀虫剂的不敏感性。,（,3,）分子生物学检测技术,害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的,即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济性等方面的原因,目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面,即检测靶标基因的突变。,常用的基因突变检测技术主要包括等位基因特异性,PCR,技术、,单链构象多态性分析、,限制性片段长度多态性分析、,DNA,芯片技术等。,等位基因特异性,PCR,技术,PASA,、,Bi-,PASA(Bidirectional,of Specific Alleles,双向,PCR,扩增特殊等位基因）的基本原理是其中一条,PCR,产物引物,3,端设置于抗性突变位点处，利用这些引物进行,PCR,扩增,S,引物能够扩增敏感害虫的基因片段,而不能扩增抗性害虫的基因片段,;R,引物则相反。,PASA,技术的使用需要针对突变碱基设计特别的引物,因此要求对引起抗性的所有碱基突变非常清楚。当在同一个碱基位点出现多种抗性突变时,需要设计多个引物,进行多次,PCR,才能确定突变的性质。,单链构象多态性（,single strand,conformation,ploymorphism,SSCP,),分析,是一种基于单链,DNA,构象差别来检测点突变的方 法,DNA,变性形成单链，在中性条件下长度相同的单链指,DNA,如果碱基组成和,(,或,),排列顺序不同,形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态性,.,这些分子在非变性,PAGE,中电泳中表现出不同的迁移率,.,SSCP,特别适于分析小于,400bp,的,PCR,产物。据认为,SSCP,可以区分,1bp,的差异,PCR-SSCP,分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,。,限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphisms,RFLP,）,分析,基因突变导致的基因碱基组成或,(,和,),顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失,.,用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在,.,限制性片段长度多态性,RFLPs,(restriction fragment length polymorphisms),样品一,样品二,DNA,芯片技术,DNA,芯片（,DNA chip),又称为基因芯片，,DNA,微阵列（,DNA microarray),仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（,oligos,or,cDNA,),有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成,DNA,微阵列。用荧光标记待测样品（,DNA,cDNA,RNA,),与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。,基因芯片按照用途分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。,该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。,（,三）抗性治理的基础研究,抗性监测,抗性品系的选育,交互抗性谱,抗性机理,抗性遗传,生物学特性,种群生态及种群遗传学等。,（,四）害虫抗性治理中的化学防治技术,1.,农药交替转换使用：,不同抗性机理的药剂间交替使用；,2.,农药的限制使用：,限制使用时间和次数；,3.,农药混用：,避免产生交互抗性和多抗性；,4.,增效剂的使用：,凡是在一般浓度下单独使用时对昆虫并无毒性，但与杀虫剂混用时，则能增加杀虫剂的效果。,（,四）害虫抗性治理中的化学防治技术,1.,综合治理,2.,负交互抗性农药的应用,3.,农药的混合使用,4.,农药的交替使用,5.,两种杀虫剂的棋盘式用药,6.,换用新药剂,7.,增效剂的使用,1.,综合治理,根据有害生物综合防治（,IPM,）,的原则，加强预测预报，把农业技术，化学防治与生物防治结合起来，减少杀虫剂的使用量，害虫综合治理强调自然控制因素的作用，强调各种防治方法必须与自然控制相协调，主张用那些与自然因子不矛盾的方法，化学方法尽可能的不用，除非到万不得已时再用。,但是，实际情况是多数农业害虫和卫生害虫还不得不用化学防治法，因此必须改进化学防治法，使杀虫剂的应用尽量不伤害天敌，这就是合理用药。,合理用药主要是两种情况：,用选择性杀虫剂，只杀死害虫，而不杀死其天敌；,选择性用药，即药剂本身不具有选择性，但通过恰当地使用方法，使其不伤害或少伤害天敌，,常用的方法有：,（,1,）调节使用剂量 （,2,）调节施药时期,（,3,）局部用药 （,4,）减少施药次数,例如不用杀死,99,，而只要求用杀死,80,的剂量。后者虽对天敌有些伤害，但杀死的较少，这样使留下来的,20,被天敌自然控制。,调整用药时期就是在害虫发生，但天敌未大量出现的时期施药，避免或减少对天敌的危害，以延缓抗性的形成。,局部施药是一个防止抗性形成的有效措施，只对虫源发生地、越冬场所、害虫栖息地或害虫严重发生区域施药，使不施药的地区害虫生存下来，它们一般为害不严重，因为它们未经过药剂选择，主要是感性个体，就可以和施药地区的抗性个体杂交，以防止抗性基因的积累。,2,.,负交互抗性农药的应用,负交互抗性是利用反选择作用。例：某些有机磷化合物（如敌百虫、久效磷等）与某些拟除虫菊酯杀虫剂（如二氯苯醚菊酯、溴氰菊酯等），在某些昆虫中（如家蝇、库蚊、棉蚜等）有负交互抗性现象，可用来防止这些害虫对有机磷或对菊酯类农药的抗性。,3.,农药的混合使用,不同作用机理的农药混用，不仅能延缓害虫的抗药性，而且能其到兼治病虫草害，增强药效，减少用药量，降低成本的作用。国内大都用有机磷与菊酯类药剂混配。,4.,农药的交替使用,交替使用作用机制不同的杀虫剂，可延缓和克服害虫抗药性的产生与发展。,例如对库蚊采用三种杀虫剂（残杀威、双硫磷、二氯苯醚菊酯），每种用,3,年，可以看到抗性在,3,、,6,、,9,年时，都有提高，但没有发展下去，抗性没有形成。前,3,年由选择形成的抗性基因虽有所增加，但在后,6,年中被稀释作用及微弱的反选择作用所抵消。,感性个体与抗性个体杂交，起到了稀释作用。,5.,两种杀虫剂的棋盘式用药,A,B,A,B,A,B,B,A,B,A,B,A,A,B,A,B,A,B,B,A,B,A,B,A,利用稀释作用，即利用感性个体与抗性个体杂交，防止抗性基因的积累。在不同地块采用不同的杀虫剂（互相之间不具有交互抗性），进行害虫的防治。,施药方法如右图,6.,换用新药剂,已产生抗药性的地区改换新的杀虫剂（无交互抗性的药剂），如抗内吸磷的棉红蜘蛛可用石硫合剂，抗敌百虫的菜青虫用乙酰甲胺磷防治。,但农药开发的速度远远比不上害虫产生抗性的速度，合理换用新药剂要有预见性。,7.,增效剂的使用,现在注册使用的增效剂主要有,5,种：,增效磷；增效脒、丙基增效剂、,亚砜化合物、增效菊。,增效剂效能的大小用增效比值（增效倍数）来表示，凡其值明显大于,1,，即表示有增效作用。,本章思考题,1.,害虫的抗药性有哪些类型？,2.,各种抗性的定义。,3.,抗性指数如何计算？如何进行抗性的分级？,4.,害虫抗性的形成有哪些学说？,5.,害虫产生抗性的机制。,6.,延缓与克服害虫的抗性可采用那些措施？,