细胞培养常用技术.ppt

<p>,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞培养常用技术,Cell,第一类研究方法,形态观察技术,第二类研究方法,生物化学分析技术,第三类研究方法,V,细胞生理学技术,第四类研究方法,其它实验技术,第一节 细胞形态结构观察技术,目镜,物镜,集光器,载物台,光源,1.,普通光镜的结构,:,（一）普通光学显微镜,一、光学显微镜,2.,普通光镜的成像原理,2,图像,样品,光线,聚光器,物镜,光学显微镜的光路图,分辨率,分辨率,指,显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,，通常是用相邻两点间的距离来表示,.,与数值孔径的关系：,D=0.61/NA=0.61/Nsin(/2),D,为分辨率,;,为光波波长,;,要提高分辨率，可采取使用短波长光源、采用介质折射率高的袖浸系、增大孔径角以提高,NA,值等措施。,倒置显微镜,生长良好的细胞，在显微镜下可观察到,细胞透明度大，折光性强，轮廓不清,。,若细胞生长状态不良，可见,细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物,。,显微镜观察,细胞的生长状态,BMSCs,培养细胞的生长过程,Anip973,在普通光学显微镜下，细胞结构呈,半透明状,，不易看清。,往往将标本切片进行,染色,提高可辨程度,。,移动臂,蜡或树脂包埋的样品,切片用钢刀,样品切片蜡带,伸展在盖玻片和,载玻片之间的切片,切片机,染色的原理,未染色,已染色,(,二,),暗视野显微镜,这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。,中央遮光板,暗视野聚光器的设计原理,视野的背景黑,物体的边缘亮,利用这种显微镜能见到小至,5nm,的质点，分辨率比普通显微镜高了,40,倍,，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。,(,三,),相差显微镜,由荷兰物理学家,F.Zernike(1932),发明,：,提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。,获诺贝尔物理奖,(1953),(phase contrast microscope),光通过不同密度物质时滞留的时间,不同，利用相差板，将,厚度,的差别转,化成,明暗,的差别，增加反差。,特点,：在聚光器或光源上加了一,环形光阑,(annular diaphragm),在物镜中加了一,环形相板,(annular phase plate),。,相差显微镜的构造,:,上有一环形区，制成,凹槽,或,凸起,（亦可涂上特殊物质）：,环形区的设计深度（或高度）恰好可,使通过此区的光线提前或延后,1/4,光程差,。,环形光阑,环形相板,使透过聚光器的光线形成,空心光锥,，焦聚到标本上。,相差显微镜的构造,相差显微镜,的光路图解,根据设计，,只有未透过标本的直射光可通过相板环形区,，,而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过,。两组光线和轴后发生干涉现象。,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成,暗反差,（,正反差,）,结构比周围介质更加变暗。,未透过标本的,直射光,（通过相板环形区,）,与,透过标本的,偏折光,（由相板其他部分通过）,和轴,后发生,干涉,：,S-D,S,D,如果为,凹形相板,：,通过样品的光线延后,1/4,-1/4,-1/4,则两组光波相加，振幅加大，形成,亮反差,（负反差）,标本结构比周围介质更加变亮。,S+D,S,D,如果为,凸性相板,：,由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。,-1/4,+1/4,显微镜观察,相差显微镜,（,phase contrast microscope,）,活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。,20,世纪,30,年代 荷兰,Zernike,原理：,利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。,相差显微镜观察活细胞的步骤如下：,调整好相差显微镜,观察瓶皿准备,调光,调焦与摄影,细胞观察,(,四,),微分干涉差显微镜,Nomarski,(1952),在相差显微镜原理的基础上发明的：又称,Nomarski,相差显微镜,，其优点是,能显示结构的三维立体投影影像,。,(differential interference contrast(DIC)microscope),与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。,DIC,显微镜首先,DIC,利用的是,偏振光,。此外，除了物镜外，还增加了四个光学组件：,偏振器,(polarizer),、,DIC,棱镜,、,DIC,滑行器,和,检偏器,(analyzer),。,DIC,显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像,基因注入,、,核移植,等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。,DIC,显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,普通显微镜,荧光显微镜的成象原理,(,五,),荧光显微镜,分裂细胞的,免疫荧光图像,不同荧光染料,标记,抗 体,特异性结合,免疫荧光技术,抗原,(,细胞的蛋白质成分,),用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布状态,MPM-2,DAPI,Merged,Inter,Pro,Meta,Ante,Telo,(,六,),激光共聚焦显微镜,(Laser,Confocal,Microscope,LCM),光源：,通过共聚焦可进行光学切片,对固相、液相物体均可进行观察,特点：,激光,Q550MW型LCM,二,.,主要电镜制作技术,三,.,扫描隧道显微镜,一,.,电镜基本知识,二、电子显微镜,电镜问世的必然性,光学显微镜 ,0.2m,电子显微镜 ,0.2 n m,透射电子显微镜,（,transmission electron microscope,，,TEM,）,扫描电子显微镜,（,scanning electron microscope,，,SEM,）,电子显微镜与光镜的主要区别,电 镜,光 镜,电子束,可见光,电磁透镜,玻璃透镜,电磁聚焦,机械聚焦,超薄切片,(0.05,m),石蜡切片,(110,m),光 源,透 镜,聚焦方式,切片厚度,图 像,彩色图像,黑白图像,0.61,D=,NSin,/2,：,波长,N,：,介质折射率,：,物镜镜口角,（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）,通常,最大值,可达,140,，,空气中,N=1,，,最短的可见光波长,=450nm,，,因此，普通光镜的,最大分辨率,是,0.2,m,。,肉眼的分辨率为,0.2mm,，,因此，光学显微镜的最大的,放大倍数,为,1000,。,放大倍数,=,显微镜的分辨率,人肉眼的分辨率,分辨力,(resolution),是指,显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：,一、电镜基本知识：,各种光及电子束的波长,Ruska,(19331938),便选择了,电子束为光源,来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了,透射电子显微镜,(,transmission electron microscope,TEM,),。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，其波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,V,1,透射式电子显微镜,(TEM),中幼红细胞透射电镜,血小板纵切面透射电镜,由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有,0.05,m,的,超薄切片,，并放在铜网上。这种切片需要用,超薄切片机,制作。电子显微镜的放大倍,数最高可达近,百万倍,。,1.,超薄切片技术,二、主要电镜制作技术：,超薄切片,铜网,以锇酸和戊二醛,固定,样品，以环,氧树脂,包埋,，以,热膨胀或螺旋推,进的方式推进样,品,切片,，切片厚,度,2050nm,，,切片,采用重金属盐,染,色,，以增大黑白,反差。,用,重金属盐,（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行,染色,；吸去染料，样品干燥后，样品,凹陷处,铺了一薄层重金属盐，而,凸出处,则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达,1.5nm,左右。,示,肌动蛋白纤维,2.,负染色技术,亦称,冰冻断裂,(freeze-fracture),，,是研究,生物膜内部结构,的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,冰冻断裂技术也是研究,细胞内部各种细胞器结构,的有用手段。,(freeze-etching),3.,冰冻蚀刻技术,将标本于,-100,干冰中或,-196,液氮中，,超低温冰冻,。,然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构,蚀刻,(etching),。,蚀刻,断裂,冰冻蚀刻技术的操作步骤,:,蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为,复膜,(replica),。,复膜,复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,细胞冰冻断裂后的电镜图像,电子枪发射出的电子束作为,“,探针,”,，在样品表面进行扫描，电子束激发样品表面放出,次级电子,，次级电子的多少与样品表面的结构有关，被电荷的栅极收集后，即向,电子显象管,发送信号，在荧光屏上相应位置显示出明、暗差别,。图像为,立体形象,，反映了标本表面的真实结构。,用来观察标本的,表面形态结构,。,(scanning electron microscope,SEM),4.,扫描电镜技术,当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。,探针,物质,扫描式电子显微镜,扫描式电子显微镜,耳听毛的扫描电镜图像,其关键部件是有一个,加上一定电压的精密探针,，当探针接近物质时，由于,隧道效应,而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,1981,年，,Binnig,、,Rohrer,等发明：,荣获,1986,年诺贝尔奖,！,据量子力学中,隧道效应,设计，用来,显示晶体表面原子布阵,(scanning tunneling microscope,STM),+,+,100nm,三、扫描隧道显微镜：,分辨率：,X-Y,向,0.1nm,（,原子级分辨率）,扫描隧道显微镜能直接观察,生物大分子,(,如,DNA,、,RNA,和蛋白质等,),的原子布阵,，也能观察一些,生物结构,(,如生物膜、细胞壁等,),的原子排列,而不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤,纳米,科学水平,。,扫描隧道显微镜的优越之处：,三态,（,固态,、,液态,和,气态,）,物质均可进行观察,。,细胞常用的观察及染色方法,活细胞的观察检测方法,暗视野显微镜技术观察活细胞,缩时显微镜摄影观察,体外活细胞染色观察,暗视野显微镜技术观察活细胞,（,dark field microscope),原理：,利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。,优点：,反差增大，分辨率提高，可观察到,5nm,的微小质点。,应用：,观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。,缩时显微摄影术观察,（,time-lapse,cinemicrophotagraphy,，,TLCM,）,优点：,可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。,缺点：,较昂贵,体外活细胞染色观察,体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。,碱性染料,酸性染料（,台盼蓝,、刚果红、吡咯蓝）,活体染料,噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）,恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）,丫嗪类（,中性红,、詹纳斯绿）,三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）,中性红染色,常用活体染料，一般浓度为,1,：,10000,，用生理盐水（或,Hanks,液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染,活体细胞,显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。,结晶紫染色,使用浓度为,0.1,，,可用生理盐水配制，室温保存。该染料对,死、活细胞,均着色，故只能测出细胞总数。,台盼蓝染色,用,0.5,浓度的台盼蓝（,trypan,blue),，用,PBS,配制，室温保存，该染料只对,死细胞,着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。,E.coli,以结晶紫,(crystal violet),染色,B.cereus,以石炭酸复红,(,carbol,fuchsin,),染色,aureus,以甲烯蓝,(,methylene,blue),染色,二、培养细胞常用的染色方法,细胞固定的基本方法,细胞常用的染色方法,细胞特殊的染色方法,1,、细胞固定的基本方法,固定组织、细胞的目的：,把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。,固定组织、细胞的原则：,尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。,固定前的准备：,各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。,悬浮细胞：,离心（,800,1000r/min,）,PBS/Hanks,漂洗,2,3,次,贴壁细胞：,用镊子轻轻取出盖片,PBS/Hanks,漂洗,2,3,次,注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。,常用固定液,简单固定液：,甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等,混合固定液：,甲醇,/,醋酸固定液、,FAA,固定液、,Carnoy,固定液、,Bouin,固定液、,4,多聚甲醛,-PBS,固定液等,甲醇,/,醋酸固定液：,甲醇：冰醋酸为,3,：,1,，现用现配，,适用于,Giemsa,染色,。,FAA,固定液：,90mL 80,酒精,5mL,冰乙酸,5mL 40,甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。,Carnoy,固定液：,较好的非水溶性固定液，,60mL,纯酒精,30mL,氯仿,10mL,冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。,2,、细胞常用的染色方法,H.E,（苏木精,-,伊红）染色法,原理：,碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。,染色结果：,细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。,细胞涂片或细胞甩片的,HE,染色,细胞涂片或细胞甩片的制备：对于贴壁细胞，可将盖玻片放于培养器皿中，让培养细胞长于玻片上，然后用药物诱导细胞凋亡后取出，用,4%,多聚甲醛固定,5min,。对于悬浮细胞，用药物诱导细胞凋亡后，离心,1000r/min,收集细胞，用,PBS,洗,2,次，收集调整细胞数为,1X10,5,/ml,，涂片或用离心甩片，用,4%,多聚甲醛固定,5min,；,苏木素染色,5min,，,用流水冲洗；,盐酸乙醇分化,30,秒；,自来水浸泡,15min,；,伊红染色,2min,脱水，透明及封片按以下步骤：,95%,乙醇（,I,）,1min,，,95%,乙醇（,II,）,1min,，,100%,乙醇（,I,）,1min,，,100%,乙醇（,II,）,1min,，,二甲苯石碳酸（,31,）,1min,，,二甲苯（,I,）,1min,，,二甲苯（,II,）,1min,，,中性树胶封片；,Giemsa,（吉姆萨）染色法,母液配制：,Giemsa,粉,0.5g,，甘油,22mL,，将,Giemsa,粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，,56,保温,2h,后，加入,33mL,纯甲醇，混匀，即为,Giemsa,母液，保存于棕色瓶内。,染液配制：,取,9,份,pH6.87.38,的,Sorensen,缓冲液和,1,份,Giemsa,母液混合即可。,染色步骤：,细胞标本用甲醇,/,醋酸固定液固定,30min,后，用滴管把染液布满玻片上，染色,1015min,，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。,染色结果：,细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。,注意事项：,染液宜现配现用，保存时间最好不用超过,48h,，,Giemsa,对,pH,极敏感，缓冲液,pH,要调准确。,瑞氏染色观察,【,材料与试剂,】,Wright,染液：称取,Wright,粉剂,0.1g,在碾钵内，充分碾磨，量取甲醇,60ml,，逐步加入，边加边碾磨，直到染料全部溶解，置试剂瓶中密封，,1,周后可用。,Wright,磷酸盐缓冲稀释液：,Wright,染液,10 ml,，磷酸盐缓冲液,20ml,。,磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾,6.63g,，磷酸氢二钠,2.56g,，蒸馏水,1000ml,。,染色缸，离心涂片机，离心机，显微镜。,其它：甲醇，,0.08%,醋酸，中性树胶。,【,操作方法,】,收集细胞（,110,6,），,PBS,洗,1,次；,将以上细胞涂片或用离心甩片机制成细胞甩片；,用甲醇固定,3,5min,；,将标本玻片插入,Wright,染液缸中染色,2 min,；,再插入,Wright,磷酸缓冲稀释液染色,4,10min,，用蒸馏水冲洗。如果颜色太深，可用,0.08%,醋酸分化数秒钟；,晾干，用中性树胶封片；,【,结果判断,】,正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色，色泽均一，,3,、细胞特殊的染色方法,Feulgen,染色法,Coomassie,染色法,PAS,反应法,油红,O,（,oil red O,）法,免疫荧光染色法,免疫酶染色法,Feulgen,（福尔根）染色法,原理：,在,60,条件下，,DNA,分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被,1mol/L,盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（,Schiff,）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，,RNA,不受影响，故染色具,DNA,特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。,此法能对,DNA,进行特异性染色,试剂配制：,1mol/L HCL,：浓,HCL 8.5ml,蒸馏水,91.5ml,Schiff,试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处,染色过程：,选用,Carnoy,固定液,染色结果：,细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。,考马斯亮蓝（,Coomassie,，,BB,）染色法,原理：,显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法,试剂配制：,固定液：,0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL,0.1mol/L Na2HPO412H2O 36.0mL,蒸馏水,50.9mL,25,戊二醛,50.0mL,染色液：甲醇,46.5mL,冰醋酸,7.0mL,考马斯亮蓝,0.02g,染色过程：,染色结构：,细胞内的微丝呈现蓝色。,过碘酸席夫反应法（,periodic acid Schiff reaction,，,PAS,）,原理：,过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（,CHOH-CHOH,）氧化成两个游离的醛基，它们与,Schiff,试剂反应生成紫红色产物。,细胞内糖类的染色方法,试剂配制：,染色过程：,染色结果：,细胞含糖原区呈紫红色。,细胞内脂类的染色方法,苏丹（,Sudan,）,/,法,苏丹黑法,Lillie,油红,O,（,oil red O,）法,Cain,硫酸尼罗蓝（,Nile,）法,锇酸（,osmic,acid,）法,油红,O,（,oil red O,）法,优点：,油红,O,染色的脂肪比苏丹,法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示，而且沉淀较少。,10,中性甲醛溶液的配制,pH 7.0,：,量取,37,40,甲醛,20mL,，蒸馏水,180mL,，加入,0.8g,磷酸二氢钠,NaH,2,PO,4,H,2,O,、,1.3g,磷酸氢二钠,Na,2,HPO,4,，配制成,200mL 10,中性甲醛溶液，密封备用。,一免疫荧光细胞化学技术,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与,显微显示的精确性相结合。用已知的抗体在不影响其免,疫学特性的前提下与荧光素相结合。然后将结合了荧光,素标记的抗体作为一种标准试剂。对被检细胞进行检测,和鉴定。并在荧光显微镜下采用一定波长的荧光，可以,直接观察被检测中有否特异荧光的表达。目前用于标记,抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（,FITC,）、四乙基,罗丹明（,RB200,）、四甲基异硫氰酸罗丹明（,TRITC,）及,藻红蛋白（,PE,）在流式细胞术（,FCM,）中较常用。较为经,典的方法有下列几种：,（,一）直接法,是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。,依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的,优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制,备大量特异性的荧光抗体。,（二）间接法,间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗,体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间,后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素,标记抗抗体使之形成被检抗原抗体荧光素标记抗抗体,复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光,标志物，所以其敏感性比直接法要高。,组织切片,组织切片,直接法,间接法,Ab,1,-,荧光,Ab,1,Ab,2,-,荧光,免疫荧光法原理图,（三）补体法,这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补,体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原抗,体抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易,出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。,（四）双标记法,运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特,点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一,标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接,法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体，,甚至可进行三重或多重标记法。,加入,3%,多聚甲醛固定细胞，固定,30min,后弃去。,PBS,洗涤,3,次，每次,5min,。,加,5%Tritoon-X100,室温温和震荡,15min,，,PBS,洗涤,3,次，每次,5min,。,室温下，加,1%,山羊血清封闭,1h,，同时在水平摇床温和振荡孵育。以,1,：,200,比例加入一抗，室温下振荡孵育,1h,，,PBST,洗涤,3,次，每次,5min,。,以,1,：,200,比例加入,FITC,标记的羊抗鼠二抗，室温下振荡孵育,1h,，,PBST,洗涤,3,次，每次,5min,。,最后加入,DAPI(1,：,1000),进行核染色,5min,，,PBS,洗涤,1,次，立即到荧光显微镜下观察。,单色荧光染色,双色荧光染色,多色荧光染色,二、免疫酶细胞化学技术,免疫酶细胞化学技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效，快速催化作用彼此结合，由此形成一种既具有免疫荧光、放射免疫的优点，又避免了他们的缺点。这项技术的原理和操作与荧光法有许多相似之处，所不同的是用酶来替代荧光素作为标志物，并采用底物被酶分解后的显色反应来显示抗原抗体的结合与否。选用的标记酶有辣根过氧化物酶,HRP,、碱性磷酸酶（,AP,）、葡萄糖氧化酶（,GOD,）、,D,半乳糖苷酶（,D,Gal,）等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质相对较稳定且部分已制成试剂盒出售。目前已广泛地被临床和实验室所应用,细 胞,二步酶标法,三步酶标法,Ab,1,-,酶基团,Ab,1,Ab,2,-,酶基团,免 疫 酶 标 法 原 理 图,（一）,辣根过氧化酶免疫酶标记法,辣根过氧化酶是从辣根中提取的一种糖蛋白，其作用底物为供氢体和过氧化物。目前常用的供氢体为二氨基联苯胺（,DAB,）。在酶反应过程中,DAB,不断供给复发物电子，使其成为在光镜下能观察到的不溶性深棕色多聚合物。定位与酶活力处即抗原抗体反应部分。,现常用的方法有,-,直接法,;,间接法,;,抗体桥联法,;,过氧化酶抗过氧化酶复合物法（,PAP,）,;,亲和素生物素过氧化酶复合物法（,ABC,）等。在组织细胞相关抗原检测中通常使用,PAP,法和,ABC,法这两种。,（二）免疫碱性磷酸酶标记法,碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶。从大肠杆菌中提取的此酶最适,PH,为,8.0,左右。其作用的底物有磷酸萘酚,AS,MX,和磷酸萘酚,AS,BI,，显色的偶联剂可采用固红,-GBC,和固蓝,-BB,等。免疫碱性磷酸酶染色方法很多，有直接法；间接法；,APAAP,法；,ABC,AP,法；但,APAAP,法和,ABC,AP,法二种，较为常用，且这二种方法其敏感性和特异性均较满意。,在被检细胞周围,(,或细胞内,),见到红色沉淀物，即为阳性反应,CD,13,+,免疫酶桥联,(APAAP),法染色原理,细胞,Ab-1,（,Mo,）,Ab-2,（,Ho,）,Ab-3,（,Mo,）,APAAP,步骤,1,、固定细胞（冰冻切片或细胞涂片不需抗原修复）。,2,、阻断内源性过氧化物酶,(198,毫升甲醇或水,+2,毫升,30%H2O2),室温,20,分钟。水洗。,3,、滴加正常血清,37,，,30,分钟。,4,、适当稀释的特异性抗体，,37 60,分钟，或,4,过夜。,5,、,TBS,或,PBS,（,pH7.2,）洗,3,次。,6,、甩桥抗体，,37 40,分钟或室温,1,小时。,7,、,TBS,或,PBS,（,pH7.2,）洗,3,次。,8,、滴加适当稀释的,APAAP,复合物，,3730,分钟。,9,、,TBS,或,PBS,（,pH7.2,）洗,3,次。,10,、滴加,AKP,底物溶液，,37 1530,分钟，阳性结果显现清晰后流水冲洗。,11,、复染（核固红或苏木素或甲基绿）,12,分钟，常规冲洗后，封片。,APAAP,法,APAAP,：属于非标记抗体法，通过具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体，并在抗酶抗体中加入大量的碱性磷酸酶，使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上，形成可溶性的,APAAP,复合物，常用的显色剂为,BCIP/NBT,、固红或固蓝。特点不会与内源性过氧化物酶反应，所以背景较为干净，特别适合内源性过氧化物酶较多的组织，如肝、肾。,Ab-1,细胞,生物素化二抗,ABC,复合物,生物素化,Biotion,（,HRP/AP,）,ABC,法染色,原理图,卵白素,（,Avidin,）,ABC,法（,SP,、,SABC,法步骤相同）,ABC(avidin,-biotin,comeplex,),卵白素,-,生物素复合物法属于亲和免疫组织化学技术，根据卵白素,-,生物素高亲和力的生物学特性。而,S-P,、,SABC,是以标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链酶素（,SA,）代替,ABC,复合物，但由于,SA,分子量较小，穿透性较好，反应速度较快,敏感性高，复合物也不需要使用前混合，更为简单方便。,ABC,为三步法，第二抗体为生物素化的,IgG,（或,IgM,、,IgA,等），其中的,Fab,片段与第一抗体结合，这就要求与第一抗体相配对，如第一抗体是鼠抗，第二抗体应该为抗鼠的（或,IgM,、,IgA,等）。由于卵白素和生物素亲和力强，故,ABC,较,PAP,敏感,20-40,倍。最后通过复合物上的过氧化物酶与显色反应形成有颜色的沉淀物，可用显微镜观察。,ABC,法步骤：,1,、固定细胞（冰冻切片或细胞涂片不需抗原修复）。,2,、阻断内源性过氧化物酶,(198,毫升甲醇或水,+2,毫升,30%H2O2),室 温,20,分钟。水洗。,3,、抗原修复：蒸馏水洗，放入抗原修复液（,Ph6.0,）内微波修复,20,分钟，快速冷却,.,4,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,5,、滴加正常血清,37,，,30,分钟。,6,、加一抗,37,，,30,分钟,.pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,7,、滴加二抗，,37,，,30,分钟,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,8,、,滴加,ABC,复合物，,37,，反应,45,分钟。,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,9,、,DAB,显色,3,10,分钟。水洗。,10,、苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封片。,三、多聚螯合物法,(ELPS),（一）多聚螯合物法的特点,多聚螯合物法应用了一种突破性的技术即多聚物技术，其在一条多聚肽链上螯合了相对应的第二抗和酶标志物。此法是近几年来发展较快的一种新的免疫组化技术，更由于酶连接方式较为直接，可进一步降低操作时一抗的工作液浓度，可使反应更灵敏、整个背景染色更低、染色时间短等特点。目前在临床上，特别是临床病理被广泛应用。,该法也可分为一步法和二步法。一步法是将多聚物酶,分子直接结合在特异性一抗上，而二步法是将多聚物酶,分子连接在第二抗体上。,细胞,Ab-1,酶基团（,HRP/AP,）,聚合物支架,ELPS,法染色原理,(,一步法,),ELPS,法染色原理,(,二步法,),细胞,Ab-1,Ab-2,酶基团（,HRP/AP,）,聚合物支架,多聚螯合物法，应用了酶标聚合物技术，如,EnVison,检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在葡萄糖聚合物上，再与二抗连接，形成,EnVison,二抗；象,PowerVision,检测系统，采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在氨基酸片段上。由于聚合物上超过,20,个以上的位点能与一抗结合，聚合物上的酶数量也较多，故较,ABC,、,LSAB,等方法更为敏感。最为重要的是，由于,LDP,系统二抗上没有生物素的存在，不会出现,ABC,、,S-P,等方法中出现的与内源性生物素结合的交叉反应，减少了非特异性着色，背景更为干净。,双重染色法,1,、固定细胞。,2,、阻断内源性过氧化物酶,(198,毫升甲醇或水,+2,毫升,30%H2O2),室温,20,分钟。水洗。,3,、抗原修复（选择采用）。,4,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,5,、滴加正常血清,37,，,30,分钟。（可不用）,6,、甩去多余血清，加一抗,37,，,30,分钟。,7,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,8,、滴加生物素化二抗，,37,，,30,分钟。,9,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,10,、滴加,ABC,复合物（辣根过氧化物酶），,37,，,45,分钟。,11,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,12,、,DAB,（棕色）或,AEC,（红色）显色,3,10,分钟。,13,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,14,、滴加正常血清,37,，,30,分钟。（可不用）,15,、甩去多余血清，加第二种一抗,37,，,30,分钟。,16,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,17,、滴加生物素化二抗，,37,，,30,分钟。,18,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,19,、滴加碱性磷酸酶复合物，,37,，,30,分钟。,20,、,pH7.2 TBS,缓冲液洗三次。,21,、,BCIP/NBT,显色（蓝色）,22,、水洗。,23,、甲基绿复染，脱水，透明，封固。,</p>