B-02-水体中大肠菌群测定资料.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Central Laboratory of Biology,College of Life Sciences,Hubei Normal University,Central Laboratory of Biology,水体中大肠菌群的测定,微生物学实验,【,课前预习,】,1.,典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？,2.,食品中大肠菌群数测定的意义是什么？,【,目的要求,】,1.,学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管发酵法）,2.,了解测定过程中每一步的反应原理。,3.,了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性,【,实验原理,】,大肠菌群是一群能在,37,培养,48h,内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。,大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。,发酵法：,又称多管发酵法或三步发酵法,(,此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵,3,个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（,most probable number,）表，算出食品中的大肠菌群数。,),1,),初发酵（推测试验）：,将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖,类的培养液中（,3,倍或,1,倍乳糖培养基，视所加的水样,体积和培养基体积而定），经,37 C,培养,24,h,，观察产,酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。,发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置,杜氏小套管,。,乳糖,能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而,大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气,。为便于观察细菌的,产酸,情况，培养基内加有,溴甲酚紫作为,pH,指示剂，,细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。,2,）平,皿,分离（证实试验）,水,中除,大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。,将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，,37,C,培养,24 h,，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。,平板培养基使用,伊红美蓝琼脂,（,eosin methyleneblue agar,，,EMB agar,）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为,指示剂,，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即,结合成复合物,，使大肠菌群产生,带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落,。初发酵管,24h,内产酸产气和,48h,产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。,3,）复发酵试验,(,完成实验）,将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入,1,倍乳糖培养液中，经,37,C,培养,24 h,，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。,产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；,根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。,1.,被检样品,根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等）,2.,培养基,乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基,3.,试剂,革兰氏染色液，芽孢染色液,4.,其它,显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器,【,实验材料,】,【,操作步骤,】,1,水样的采取（青山湖水，应取距水面,10-15cm,的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出）,2,湖水的检查,（,1,）初（步）发酵实验,水样的稀释：,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,（用无菌水稀释）,接种：取,0.5ml,上三个稀释度的水样,接入装有,4.5ml,三倍浓缩,乳糖蛋白胨发酵管（水样的体积和培养液的体积由试管而定），混匀后，,37,培养,24,h,。,水样接种于发酵管内，,37,下培养：,（,1,）,24h,内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；,（,2,）在量少的情况下，也可能延迟,48h,后才产酸产气，此时应视为可疑结果。,以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。,（,3,）,48h,后仍不产气的为阴性结果。,（,2,）平板分离,将经,24,h,培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于,37,培养,18,24 h,，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。,深紫黑色，有金属光泽；,紫黑色，不带或略带金属光泽；,淡紫红色，中心颜色较深。,（,3,）复发酵试验,将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验,(,利用乳糖蛋白胨培养液,),。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性。,（,4,）结果计算：,根据三个稀释度中阳性管数组成一个数量指标，查,MPN,计数表,10-1,10ml10,0,1ml10,0,1ml10,-1,1ml10,-2,3,1,1,1,1,支,各,3,支,【,实验结果,】,1.,将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。,2.,对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。,【,思考题,】,1.,在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？,2.,典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？,3.,食品中大肠菌群数测定的意义是什么？,生物学实验教学中心,