大豆蛋白的提取与含量测定.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,大豆蛋白的提取与含量测定,蛋白质化学实验,蛋白质是一切生物体内重要的组成成份，蛋白质是由二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子化合物，溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。,蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间构型。在各种物理化学因素影响下，由于副价键的破裂，使其空间结构遭受不同程度的破坏，蛋白质的物理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋白质的变性。,蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定条件下（如,PH,，,离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分子的大小及形状等方面的差异，可以采用电泳，离子交换柱层析等方法对它们进行分离分析。,许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度，产生可逆或不可逆沉淀，这些因素（如增加溶液的离子强度，降低溶液的介电常数，调节溶液的,PH,等）以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来分离，提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌握好理论和实践相结合，把学到的理论应用到实验中，本系列实验安排是从一种生物中提取蛋白质，通过各种物理化学性质使其得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。,蛋白质性质与应用技术关系图,蛋白质,酸碱,酶,极性,电荷,离子交换层析,电泳,形状,分子量,离心,凝胶层析,肽 氨基酸,疏水性,亲水性,低,层,析,一、,大豆蛋白的提取,目的要求,1,、,掌握大豆蛋白的提取原理和方法,2、计算粗提产率,2,、学习计算蛋白质收率,实验原理,大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。,称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。,试剂和器材,1,、试剂,（,1,）,10%,Nacl,（,2,）,0.2%NaoH,（,3,）,75%,乙醇,（,4,）,6,mol/L HCL,（5）1mol/L HCL（6）1 mol/L NaoH,2,、器材,（,1,）离心机,（2）烧杯,（3）滴管,（4）,PH,试纸等,操作方法,1,、,水抽提,将豆粉,5,g,用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提,15,min,，,3800r/min,离心,15,min,，,取上清液，如上清液不清澈再经过滤。,取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。,其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌）,6,mol/L,和1,mol/L,HCL,，,调,PH4.55.0,，,3800r/min,，,离心,15,min,，,收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。,蛋白质产物重量,蛋白质产率,=100%,原料总重量,思考题,1,、用丙酮沉淀蛋白时，为何要调,PH4.55.0,？,2,、,大豆中哪类蛋白含量最多？,Folin,酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分,Folin,酚法测定蛋白质含量,目的要求,掌握,Folin,酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理,蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，,Folin,酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和,Folin,酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。,Folin,酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏,100,倍。,Folin,酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。,由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用,Folin,酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。,样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。,Folin,酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。,试剂和器材,1,、材料：,本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。,2,、试剂：,（,1,）,0.03,mol/L PH7.8,的磷酸缓冲液。,（,2,）,200,g/ml,的标准酪（牛血清）蛋白溶液。,（,3,）,Folin,试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：,10,g,NaoH,溶于,400,ml,水中，再加,50,gNa,2,CO,3,；,称取,0.5,g,酒石酸钾钠溶于,80,mlH,2,O,中，再加,0.25,gCuSO,4,；,以上两溶液混合定容到,500,ml,，,冰箱保存可用一个月。,4,、,Folin,试剂乙：在,2,升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（,NaWO,4,2H,2,O,）,100g,，,钼酸钠（,NaMoO,2M,2,O,）,25g,，,蒸馏水,700,ml,，,85%,的磷酸,50,ml,，,浓盐酸,100,ml,，,充分混合后，小火回流,10,小时，再加硫酸锂（,Li,2,SO,4,）,150g,，,蒸馏水,50,ml,及数滴溴。然后开口沸腾,15,min,，,以驱除过量的溴，冷却后定容到,1000,ml,，,过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。,上述制备的,Folin,试剂乙的贮备液浓度一般在2,mol/L,左右，几种操作方案都是把,Folin,试剂乙稀释至1,mol/L,的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1,mol/L,略高。这种稀释18倍后的,Folin,试剂乙就是下文称之为应用液，,Folin,试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用,Folin,试剂乙去滴定1,mol/L,左右的标准,NaOH,溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用,NaOH,去滴定,Folin,乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。,3,、器材：,试管,10,支,试管架一个,移液管：（,5,ml,、,1ml,）,移液管架,洗瓶,恒温水浴,723,型分光光度计,操作方法,1,、标准曲线的制作：,标准酪蛋白溶液：用,0.03,mol/L,的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为,200,g/ml,。,用一支,0.5,ml,移液管分别取上述标准酪蛋溶液0,ml,0.1ml,，,0.2ml,，,0.4ml,，0,.6ml,，,0.8ml,，,1.0ml,各加到一支试管中去，将此吸管用,0.03,mol/LPH7.8,的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至,1,ml,。,再在另一支试管中加入,1,ml,缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入,1,mlFolin,试剂甲并不时地进行振荡，,10,min,后再加入后,1,in,试剂乙的应用液4毫升。立既摇匀放入,55,水溶中保湿,5,min,。,取出后用自来水冷却,1,min,。,于波长,650,nm,进行比色测定各管的,OD,值，以蛋白质的浓度为横坐标，,OD,值为纵坐标，既可得到标准曲线。,Folin-,酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：,取,7,支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定,试管号,1,2,3,4,5,6,7,蛋白质标准液（,ml,）,（,mg),0,0,0.1,0.02,0.2,0.04,0.4,0.08,0.6,0.12,0.8,0.16,1.0,0.2,PH7.8,的,buffer,（,ml,）,1,0.9,0.8,0.6,0.4,0.2,0,Folin-,甲试剂,（,ml,）,1,1,1,1,1,1,1,于室温下不停地振荡,10,min,Folin-,乙应用液（,ml,）,4,4,4,4,4,4,4,立即摇匀，在,55恒温水浴中保温5,min,，,用流水冷却,1,min,后，测,A,650,A,650,值,2,、样品测定：,取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1,ml（,不加,buffer），,其他操作同工作曲线（可取两支试管编号8、9，与,工作曲线同时进行反应和比色测定）,；,试管号,8,9,蛋白质稀释液（,ml,）,（,mg),1,1,PH7.8,的,buffer,（,ml,）,0,0,Folin-,甲试剂,（,ml,）,1,1,于室温下不停地振荡,10,min,Folin-,乙应用液（,ml,）,4,4,立即摇匀，在,55恒温水浴中保温5,min,，,用流水冷却,1,min,后，测,A,650,A,650,值,3.,蛋白质浓度的计算：,A,650,值对应的,mg,数,(,Pr),Pr(mg/ml)=,稀释倍数,Pr,溶液的,ml,数,思考题,1,、采用,Folin,的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？,2,、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。,