奥赛辅导---蛋白质.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学部分知识结构,化学成分：,水、无机盐、糖类、脂类、,蛋白质、核酸、,酶,、维生素和辅酶,细胞的代谢,异化作用：,糖的异化、脂肪的异化、蛋白质的,异化,、核酸的异化,同化作用：,光合作用,、多糖合成、脂类的合成等,分子生物学：复制、转录、,翻译,、调控,蛋白质的结构与功能,第 一 章,一、什么是蛋白质,?,蛋白质,(protein),是由许多,氨基酸,(,amino acids),通过肽键,(peptide bond),相连形成的高分子含氮化合物。,组成蛋白质的元素,主要有,C,、,H,、,O,、,N,和,S,。,有些蛋白质含有少量,磷,或金属元素,铁、铜、锌、锰、钴、钼,，个别蛋白质还含有,碘,。,1,、蛋白质的元素组成：,氮的含量在多种的蛋白质比较接近，平均为,16%,，因此用凯氏（,kjelahl,）法定,N,，受检物质中含蛋白质量为,N,含量的,6.25,倍。,蛋白质含量的测定：,凯氏定氮法,(,测定氮的经典方法,),优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；,缺点：易将无机氮,都归入蛋白质中,不精确。,样品含氮量平均在,16%,，取其倒数,100/16=6.25,，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在,1g,元素氮，就说明含有,6.25g,蛋白质）；故：,蛋白质含量,=,氮的量,100/16,一、氨基酸,组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有,300,余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有,20,种,.,必需氨基酸和非必需氨基酸,：,必需氨基酸,包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）、色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等,8,种。精氨酸和组氨酸为半必需氨基酸。,2,、蛋白质的氨基酸组成,（,1,）氨基酸的结构天然蛋白质中存在的氨基酸都是,L-a-,氨基酸,COOH,|,NH,2,C H,|,R,L-a-,氨基酸,一种为,脯氨酸,，它也有类似结构，但侧链与氮原子相接形成亚氨基酸。,除,甘氨酸,外，蛋白质中的氨基酸都具有不对称碳原子，都有,L,型与,D,一型之分，为区别两种,构型,，通过与甘油醛的构型相比较，人为地规定一种为,L,型，另种为,D,一型。当书写时,NH2,写在左边为,L,型，,NH2,在右为,D,一型。已知天然蛋白质中的氨基酸都属,L,型。,非极性疏水性氨基酸（,7,）甘丙缬亮异苯脯,极性中性氨基酸（,8,）色丝酪半蛋天谷苏,酸性氨基酸（,2,）天谷,碱性氨基酸（,3,）赖精组,（一）氨基酸的分类,（二）氨基酸的理化性质,1.,两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点,(isoelectric,point,pI),在某一,pH,的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的,pH,值,称为该氨基酸的,等电点,。,pH=,pI,+OH,-,pH,pI,+H,+,+OH,-,+H,+,pH,pI,氨基酸的兼性离子,阳离子移向阴极,阴离子移向阳极,2.,紫外吸收,色氨酸（,Trp W,）、酪氨酸（,Try Y,）,的最大吸收峰在,280 nm,附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液,280nm,的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3.,茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成,蓝紫色,化合物，其最大吸收峰在,570nm,处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,氨基酸 代谢库,食物蛋白质,消化吸收,组织,蛋白质,分解,体内合成氨基酸,(,非必需氨基酸,),-,酮酸,脱氨基作用,酮 体,氧化供能,糖,胺 类,脱羧基作用,氨,尿素,代谢转变,其它含氮化合物,(,嘌呤、嘧啶等,),合成,氨基酸代谢概况,一、氨基酸的脱氨基作用,脱氨基,方式：,氧,化脱氨基,转,氨基作用,联合,脱氨基,非,氧化脱氨基,转氨基和氧化脱氨基偶联,转氨基和嘌呤核苷酸循环偶联,（一）、氧化脱氨基作用,L-,谷氨酸脱氢酶,+,H,2,O,+,NH,3,NAD(P),+,NAD(P)H+H,+,COOH,CH,2,CH,2,C=O,COOH,COOH,CH,2,CH,2,CH NH,2,COOH,*,L-,谷氨酸脱氢酶：,活性强，分布于肝、肾及脑组织,辅酶,为,NAD,+,或,NADP,+,专一性强，只作用于,谷氨酸,（二）、转氨基作用,(,transamination,),特点：,*,没有,游离的氨产生，但改变了氨基酸代谢库中各种氨基酸的比例。,*,大多数,氨基酸可参与转氨基作用，但,赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸,除外。,谷丙转氨酶（,GPT,）,谷草转氨酶,(GOT),谷丙转氨酶（,GPT,）和谷草转氨酶（,GOT,）,氨基酸,谷氨酸,-,酮酸,-,酮戊二酸,H2O+NAD,+,转氨酶,NH3+NADH+H,+,L-,谷氨酸脱氢酶,*,此,种方式既是氨基酸脱氨基的主要方式，也是体内合成,非必需氨基酸,的主要方式,。,*,主要,在肝、肾组织进行。,1,、,转氨基偶联氧化脱氨基作用,苹果酸,腺苷酸,代琥珀酸,次黄嘌呤,核苷酸,(IMP),腺苷酸代琥,珀酸合成酶,-,酮戊,二酸,氨基酸,谷氨酸,-,酮酸,转氨酶,1,草酰乙酸,天冬氨酸,转氨酶,2,腺苷酸,脱氢酶,H,2,O,NH,3,延胡索酸,腺嘌呤,核苷酸,(AMP),2,、转氨基偶联嘌呤核苷酸循环,（二）、血氨的去路,在肝内合成尿素,合成非必需氨基酸及其它含氮化合物,合成谷氨酰胺,肾小管泌氨：,分泌的,NH,3,酸性条件下生成,NH,4,+,，随尿排出。,谷氨酸,+,NH,3,谷氨酰胺,谷氨酰胺合成酶,ATP,ADP+Pi,尿素的生成,1,、生成部位：,主要,在肝细胞的,线粒体,及,胞液,中。,2,、生成过程,尿素的生成过程由,Hans Krebs,和,Kurt,Henseleit,提出，称为,鸟氨酸循环,(,orinithine,cycle),，又称,尿素,循环,(urea cycle),或,Krebs-,Henseleit,循环,。,鸟氨酸循环,2ADP+Pi,CO,2,+NH,3,+H,2,O,氨基甲酰磷酸,2ATP,N-,乙酰谷氨酸,Pi,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酸,延胡索酸,氨基酸,草酰乙酸,苹果酸,-,酮戊,二酸,谷氨酸,-,酮酸,精氨酸代,琥珀酸,瓜氨酸,天冬氨酸,ATP,AMP+,PPi,鸟氨酸,尿素,线粒体,胞 液,*,原料,：,2,分子氨，一个来自于游离氨，另一个,来自,Asp,（,天冬氨酸,）,；,*,过程,：先在线粒体中进行，再在胞液中,进行；,*,耗能,：,3,个,ATP,，,4,个高能磷酸键。,蛋白质的结构,一级结构,(1),组成蛋白质的多肽链数目,.,(2),多肽链的氨基酸顺序，,(3),多肽链内或链间二硫键的数目和位置。,其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础,。,蛋白质的结构,二级结构,-,螺旋：多肽链中氨基酸残基以,1000,的角度围绕螺旋轴心盘旋上升，每,3.6,个残基就旋转一圈，螺距为,0.54nm,；右手旋转；多肽链内的氢键由肽链中一个肽键的,-CO,的氧原子与第四个肽键的,-NH,的氢原子组成，每个氢键所形成的环内共有,13,个原子，这种螺旋称为,3.613,-,折叠：平行式、反平行式。邻近两链以相反或相同方向平行排列成片层状。两个氨基酸残基之间的轴心距离为,0.35nm,，,-,折叠结构的氢键是由两条肽链中的一条的,-CO,基与另一条,-NH,基之间所形成。,二级结构还有,-,转角、自由回转（无规卷曲）,蛋白质的结构,三级结构：,是指多肽链在二级结构、超二级结构、结构域的基础上，进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。,四级结构：,是指由两 个或两个以上具有三级结构的,亚基,按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。,通常,亚基,只有一条多肽链，但有的,亚基由两条或多条多肽链组成,，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。,维系蛋白质一级结构的作用力：,肽键、二硫键,维系蛋白质二级结构的作用力：,氢键,维系蛋白质三级结构的作用力：,范德华力、盐键、氢键、疏水相互作用,维系蛋白质四级结构的作用力：,范德华力、盐键、,氢键、疏水键。其中疏水键是最主要的作用力。,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液,pH,条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,*,蛋白质的等电点,(isoelectric point,pI,),当蛋白质溶液处于某一,pH,时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的,pH,称为,蛋白质的等电点。,蛋白质的,盐溶,、,盐析,、变性和,复性,盐溶,是指蛋白质溶液中由于加入低浓度的中性盐后，使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶。,盐析,是指高浓度中性盐可使蛋白质分子脱去水化层并中和其电荷而使蛋白质从溶液中凝集出来的现象叫做盐析。,蛋白质的变性,作用是指天然蛋白质分子由于受到物理或化学因素的影响使次级键破坏，引起天然构象的改变，导致生物活性的丧失及一些理化性质的改变，但未引起肽键的断裂，这种现象叫做蛋白质的变性作用。,蛋白质的复性,是指当变性因素除去后，变性蛋白又可重新回复到天然构象，这一现象叫蛋白质的复性。,蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在,280nm,波长处有特征性吸收峰。蛋白质的,OD,280,与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,蛋白质的呈色反应,茚三酮反应,(ninhydrin,reaction),蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应,(biuret,reaction),蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为,双缩脲反应,，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,蛋白质的分离提纯技术,一、根据分子大小不同进行分离纯化,1,、透析和超过滤,透析,和超过滤都是利用蛋白质分子不能通过,半透膜,的性质，使蛋白质和其它小分子物质分开。,超过滤,是利用,压力或离心力,，强使水和其它小分子溶液透过半透膜，而蛋白质留在膜上。,蛋白质的分离提纯技术,二、根据溶解度差别的分离方法,1.,等电点沉淀和,PH,值控制,利用各种蛋白质在等电点时，溶解度最小这一性质，可以通过调节蛋白质溶液的,PH,值，将不同的蛋白质分开。,2.,蛋白质盐溶或盐析,中性盐在低浓度时，可以增加蛋白质的溶解度，这种现象叫盐溶。当溶液离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度下降开始沉淀，这种现象叫盐析。,蛋白质的分离提纯技术,三、根据电荷不同的分离方法,1.,电泳,在外界电场的影响下，如果蛋白质不处于等电点状态，它将向电极移动，这种现象称为电泳。纯化中应用最多的是,聚丙烯酰胺凝胶电泳,和,等电聚焦电泳,，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯度、制备蛋白质。,2.,层析,层析法是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个,“,相,”,中，这两个相中的一个被固定在一定的支持介质上，成为固定相，另一个是移动的，成为移动相。,根据层析法的原理与方式的不同，层析法有,分配层析,、,吸附层析,、,离子交换层析,、,亲和层析,等不同类别。,