细胞工程理论初级基础.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 细胞工程的理论基础,细胞培养(cell culture)技术,即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生命科学等研究领域的重要技术。,动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。,动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。,组织培养的概念,组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。,A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。,B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。,从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。,C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。,体外培养的种类,二、细胞培养的现实意义,生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹,症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白,细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。,科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。,临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾,病的治疗等,三、细胞培养的优点,1.研究的对象是活细胞,在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。,2.研究条件可以人为控制,可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。,3.研究的样本可以达到比较均一性,通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。,4.研究内容便于观察、检测和记录,采用各种研究技术、记录方法：,研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原,位杂交、同位素标记-,记录:摄影照片、缩时电影、电视-,5.研究的范围比较广泛,学科多：,细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等,对象广：各种动物：低等动物-高等动物-人类 一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤-）,6.研究的费用相对较经济,可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。,四、细胞培养的缺点,现人工模拟体内环境的技术已经很高,但,人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同.当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.,因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能，又具有某些改变的，特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。,五、细胞培养的工作原则,有标准化的工作方法,培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及,抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。,一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。,第二节,组织培养的细胞生物学,一、体内外细胞的差异和分化,（一）体内外细胞的差异,培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似“反祖”现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。,1.与体内主要不同：相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响,2.主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 细胞趋向单一化；,3.提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。,（二）培养细胞的 分化,1不适应(Deadaption)：,表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.,2脱分化或去分化(Dedifferentiation),细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。,二、培养细胞形态分类,体外细胞培养物的生长类型,按生长方式:2型,粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。,悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。,绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,体外培养细胞的分型,贴附(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式,含义 两方面,结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。,粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同,按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型,分类 根据形态大致的不同，主要2类：,上皮细胞型,成纤维细胞型 其它，不定型,上皮细胞型,名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-,来源：来源于外胚层，内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：类似体内的上皮细胞,扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点,易相连成片,相靠紧密相连成薄层-铺石状,生长时呈膜状移动,很少脱离细胞群而单个活动,体外培养细胞类型（1）上皮细胞型,成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的,来源：由中胚层间充质组织起源的组织,如：真正的成纤维细胞,心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮,形态：似体内成纤维细胞的形态,胞体梭形或不规则三角形,胞质向外伸出23个长短不等的突起,中有卵圆形核,生长特点：,排列成放射状，漩涡状,并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而 单独行动,游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型,贴附生长型-类型,1.与体内同名的细胞不完全相同,如：形态相似的成纤维细胞，可不同来源,自同一动物不同组织的成纤维样细胞相似但 发展趋向不同,2.培养细胞的形态不稳定,条件改变，细胞形态可有变化,培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞,生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后,成纤维样 可成上皮样,悬浮生长型,概念,培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长,或以机械方法使保持悬浮状态下生长,来源,自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞,癌肿细胞也可能,特点,在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团,优点 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获,可获得稳定状态,缺点,观察不方便,很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长,来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞,特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团,优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，,易于收获，可获得稳定状态,缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细,胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色,1.细胞种类：HL-60；2.培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：1640+8胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或,消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU812,1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞,1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,三、培养细胞的生长特点,（一）贴附,（二）接触抑制,（三）密度抑制,四、培养细胞的生长和增殖过程,（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells),培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,游离期,悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。,吸附期,贴附底物，一般24小时内贴壁。,潜伏期,此时细胞有生长活动，基本无增殖。,细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进,行实验研究。,停止期（平台期）,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂,机制：接触抑制、密度依赖性,原代培养(Primary Culture)期,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一,次传代阶段，一般持续1-4周。,特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与,体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,传代期,特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺,盛，并能维持二倍体核型。,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,衰退期,特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，,最后衰退凋亡。,（二）体外培养细胞一代生存期,潜伏期,指数增生期,停滞期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,（三）单个细胞的生长过程,（四）、体外培养细胞的遗传学特征,（1）核型变化,（2）永生化和恶变,（3）细胞性别,（五）、体外培养细胞的生存环境,（一）无污染环境,（二）温度,（三）气体环境和氢离子浓度,（六）、体外培养细胞生存所需基本物质,（1）糖,（2）氨基酸,（3）维生素,（4）促生长因子,（5）其它物质,（七）细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是：,在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。,细胞低温保存的关键：,在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,慢冻程序,4 10 分钟,20 30 分钟,80 16-18 小时(或隔夜),液氮罐长期储存。,冻存管,1.2ml,2ml，,5ml,液氮罐,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37,38水浴中，使其融化（1分钟左右）；,（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；,（3）低速离心10分钟；,（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。,常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。,也有用甘油的,冻存液：,含20%血清培养基,10%DMSO（或10甘油）,DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目一般为1106 cells/ml,融合瘤细胞则以5106 cells/ml 为宜。,细胞的运输技术,（八）细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类:,细菌、酵母菌、霉菌和病毒,污染源:,无菌操作技术不当;,操作室环境不佳;,污染之血清;,污染之细胞.,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。,洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状,细菌和真菌的污染和检测,肉眼直接观察法,培养检查法,显微镜观察法,.支原体的污染和检测,Hayflick培养基直接培养法,DNA荧光染色法,PCR方法,相差显微镜观察法,测出细胞株有支原体污染时，应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,病毒的污染和检测,细胞的直接观察,动物接种检查,电子显微镜观察,免疫学检查,PCR技术,第三节 建立细胞系或细胞株,一、体外培养细胞的种类和命名,（一）初代培养(原代培养),初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。,一旦已进行传代培养(subculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,原代培养,直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。,优点：,组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养,1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养；细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁,后呈不规则。,(二）传代培养,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养,原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,HepG2细胞,细胞种类：人肝肿瘤细胞；培养的天数：传代培养2天；细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则,贴壁生长，成团聚集。,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：,1悬浮生长细胞传代,离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新,培养液后再混匀传代。,2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用,直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,3贴壁生长细胞传代,采用酶消化法传代。,常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代；,原代培养的贴壁细胞需控制消化时间；,吹打已消化的细胞应减少机械损伤；,首次传代时细胞接种数量要多一些；,首次传代培养的pH应偏低些；,小牛血清浓度可加大至15%20%左右。,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示,细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同,血细胞计数器：手工计数细胞,Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板,上。,2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满,盖片和计数板之间。,3、静置3分钟。,4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。,细胞数/ml4大格细胞总数/4104,注意：压线细胞只计左侧和上方的。,镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力：,总细胞中活细胞所占的百分比,由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。,复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。,流式细胞仪,细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；,MTT比色法的原理：,活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。,二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。,甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；,传代注意事项,接种数量为51048105个/ml,传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。,培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。,如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞系（Cell Line）,培养物开始第一次传代培养后的细胞,有限细胞系（Finite Cell Line）,连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）,肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。,肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞,具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株,细胞株:用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群。,再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,克隆细胞株,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养,或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细,胞株。,细胞培养板,6孔，,12孔，,24孔，,48孔,96孔,二倍体细胞,培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数,相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。,肿瘤细胞系或株,是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考；,HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌),CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary),宫743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立,NIH3T3：美国国立卫生研究所(National Institute of,Health)建立,每3天传代一次，每次接种,3106细胞毫升。,细胞系或细胞株的命名,二、建立细胞系（或株）的要求,（一）组织来源,（二）细胞生物学检测,（三）培养条件和方法,何处购买细胞,ATCC（American Type Culture Collection）细胞库(www.atcc.org).,美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。,目前它可以提供以下物品,细胞系3000种,细菌和噬菌体 15000种,动植物病毒 2500种,原生动物 1200种以及重组物品,欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB),国内细胞库,中国科学院细胞库,中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：地址：上海市岳阳路320号，200031电话：[phone]Fax:[phone]联系人：陈松华，徐惠均e-mail:shchen,一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。,三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用,培 养 简 历：,组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、,供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。,冻 存 液：,培养基和防冻液名称。,细 胞 活 力：,融解前后细胞接种存活率和生长特性。,培 养 液：,培养基种类和名称(一般要求不含抗生素)，血,清来源和含量。,细 胞 形 态：,类型，如为上皮或成纤维细胞等。,核 型：,二倍体或多倍体，标记染色体的有无。,无污染测验：,包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等。,物 种 检 测：,检测同功酶，主要为G6PD和LDH，以证明细,胞有否交叉污染。,免 疫 检 测：,一两种血清学检测。,细胞建立 者：,建立者性名；检测者姓名。,