生物样本分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物样本分析,岛津,自动前处理,系统,（,Co-Sense for BA,LCMS,）,药,代动力学研究的内容,药代动力学应用动力学原理研究药物吸收、分布、代谢和排泄过程。,药物剂量与药理效应的相互关系研究,人体生理及病理状态对药物体内过程的影响,药物制剂的生物利用度测定,药物相互作用评价,生物样品包括各种体液和组织,血浆中微量药物或代谢产物的测定,药物化学结构的特点,世界药物索引,1999,收载,药物总数：,51596,可离子化药物：,62.9%,，其中,酸性化合物,14.5%,碱性化合物,67.5%,两性化合物,18.0%,分子量一般,500,离子化 质谱分析,血浆样品的特点,基质复杂 选择性强,待测物含量低 灵敏度高,浓度差异大 线性范围宽,生物样品中的药物分析前处理的要点,除蛋白质，分离纯化,浓缩,液液萃取法,固相萃取法 规模缩小的柱色谱法,直接沉淀法,超滤法,血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）涡旋离心取上清液吹氮气浓缩残渣溶解过滤进样,色谱分析,样本前处理一般步骤,药代动力学研究面临的挑战,高效液相色谱法（,HPLC,）,的特点和局限：,灵敏度：定量限一般为,10,100 ng/ml,，,选择性差,测试速度：每个样品,15,20 min,，,低通量,对结构分析提供的信息很少,需求：,灵敏度：,ng/ml,浓度，高选择性,制剂生物等效性实验：,500,1000,样品,新药研究：分析超过,10000,个生物样品,液相色谱,-,质谱联用法的发展,1977,年，,LC/MS,开始投放市场,1978,年，,LC/MS,首次用于生物样品分析,1991,年，,API LC/MS,用于药物开发,数据来源：,American Society for Mass Spectrometry,2002,药物色谱分析中不同方法的比例,1990,年,2000,年,LC/MS,法测定人血浆中克拉霉素的浓度,克拉霉素(,clarithromycin,),红霉素衍生物,新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素,以往克拉霉素血药浓度测定,多采用微生物法,HPLC,紫外检测,克拉霉素,检测,条件,流动相:0.05%冰醋酸和乙腈（4060,v/v）,流速:0.2,mL,/min,色谱柱:,Shim-pack ODS 150mm,2.0 mm I.D.5,m,柱温:40,质谱离子化方式：电喷雾离子化（,ESI）,离子极性:,Positive；,选择性离子检测(,SIM):,克拉霉素,m/z:748.5M+H+,罗红霉素,m/z:837.5 M+H+,内标物,14-,羟基克拉霉素,m/z:764.5M+H+,血浆样品的处理,血浆,样品,内标罗红霉素,碳酸钠溶液,碱化后,乙醚,提取,上清液用氮气吹干。,最后,残渣乙腈溶解。,方法的专属性,克拉霉素、内标、14-羟基克拉霉素的保留时间分别为1.93,min、1.93min、1.92min,岛津,自动前处理,系统,（,Co-Sense for BA,LCMS,）,内容,自动前处理的优点与问题,自动前处理系统,Co-Sense for BA,的特长,采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率,使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度,Co-Sense for BA+LCMS,系统的特长,背景,样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。,HPLC/LC-MS,广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（,restricted access media-RAM,）,的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作和提高工作效率。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性,。,生物样品中的药物分析前处理的要点,除蛋白质,浓缩,手工前处理的问题,处理时间,重现性,药物回收率,前处理的现状,除蛋白、浓缩操作自动化的优点,提高分析精度,脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。,提高操作简便性,脱线处理时需操作熟练,提高处理效率,夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率,前处理自动化的课题,提高回收率及提高浓缩率,自动前处理的优点和课题,提高回收率的手段,有必要使与蛋白质结合的药物游离出来,与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。,切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合,）,调整样品导入溶液的,pH,值,碱性药物时，使用,pH,值低的溶液,酸性药物时，使用,pH,值高的溶液,调整样品导入溶液的离子强度,20-100mM,的缓冲液浓度,在样品导入溶液中添加有机溶剂,在,20%,以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）,使用界面活性剂,(*),从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的,pH,值较为理想。,方法,我们研究开发出优质的限制性通路媒介（,RAM,）,预柱，应用柱切换,HPLC,系统及其在线稀释旁路系统,，,可对血浆直接进行药物分析。,我们的系统,.,回收率,即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集），,并且回收率几乎达到,100%,灵敏度,目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此,。,不会造成峰值恶化。,耐用性,新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是,长时间的实验也能如此。,Co-Sense for BA,何谓,C,o-Sense for BA,用于分析生物样品的应用系统,具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱,Shim-Pack,MAYl,-ODS,的组合，实现了真正的血浆（血清）的直接大量注入。,特长,可对应蛋白质结合率高的药物,使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时,也可有效地捕集，回收率几乎,100%,。,超高速进样和无限接近零的交叉污染。,-,使用高效自动进样器,迅速且有效地除去蛋白,有效地保护分析柱色谱柱和,LC/MS,的接口,经久耐用的新型柱,通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据,。,自动前处理系统的基本流路,泵1,泵2,前处理柱,分离柱,自动进样器,检测器,流动相,导入溶液,自动前处理系统的基本流路,泵1,泵2,前处理柱,分离柱,自动进样器,检测器,流动相,导入溶液,通过对样品导入溶液进行最优化，可提高回收率。,但是，为了提高浓缩效果而大量进样时的回收率会怎样呢？,血浆（血清）样品的大量进样时的回收率？,因大量进样，回收率降低。,通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）样品。,这便是,Co-Sense,的关键技术！,自动进样器,前处理柱,在线稀释流路,导入泵,在线稀释流程图,样品处理柱的容量,进样体积对色谱图的影响,当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象,.,100 uL,50 uL,10 uL,100 uL,50 uL,10 uL,不同进样体积的影响,10 uL,Drug,Protein,100 uL,小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子,大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低,在线稀释泵提高回收率的原因,Auto-sampler,Pretreatment column,Sample introduction pump,在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离,Auto-sampler,Pretreatment column,Sample introduction pump,90%,10%,Free Drug,Dilution,pump,Shim-pack MAYI-ODS,（,RAM,）,预处理柱,采用,Shim-pack MAYI-ODS,除蛋白,蛋白质等大分子,药物,涂覆膜,将硅胶（,50,m,）,的外表面用亲水性聚合物涂覆，只将细孔内部用十八烷基进行化学修饰。象蛋白质这样的高分子不能进入细孔内部，并被外表面的亲水性聚合物阻挡，不在固定相上保留，很快地洗脱。另一方面，诸如药物这样的通常的小分子化合物则浸透到细孔内部，被保留在内部表面的固定相上。,column name;,Shim-pack MAYI-ODS,packing material;,silica particle,outer surface,methyl cellulose,inner surface,octadecylsilyl group,particle size;50mm,column size;,4.6mm,i.d.,x 10mm,pH range;2-7.5,maximum pressure;,20MPa,涂渍的甲基纤维素表面,药物,蛋白质,ODS,表面,预处理柱,Co-Sense for BA,的流路构成,样品通过在线稀释旁通的作用，导入溶液自动稀释，被导入,MAYI-ODS,前处理柱。在除蛋白的同时，捕集、浓缩药物,Step1.,除蛋白质的捕集浓缩,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,导入样品泵,检测器,被,MAYI-ODS,捕集的药物，经阀切换，导入分析柱,Step 2.,分析经浓缩的药物,导入样品泵,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,检测器,在线自动稀释用旁通流路的效果,0,4,12,16,8,Time(min),标准,溶液,无旁通,有旁通,样品,：,消炎痛,(1 mg/L),添加血浆,样品导入液（稀释液）,：,0.1,磷酸水溶液：乙腈,=95,：,5,注入量,：,500,L,稀释倍率,：,8,倍,检测：,UV 315nm,用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价,无稀释旁通流路：回收率约,50%,。,有稀释旁通流路：回收率几乎,100%,自动浓缩带来的高灵敏度,100L,注入,200L,注入,500L,注入,0,12,4,8,16,Time(min),样品,：,消炎痛,(1 mg/L),添加血浆 无峰形歪斜,样品导入液（稀释液）：,0.1%,磷酸水溶液：乙腈混合液（,95,：,5,）,检测：,UV 315nm,实现高灵敏度,实现高灵敏度的大量注入的稳定性,捕集效率,即使注入血浆,500,L,，,回收率也几乎达到,100%,。,峰形状,样品名：添加消炎痛的血浆,流动相,(,样品导入溶液,),：,100mM,醋酸钠缓冲液,血浆样品中药物回收率测定,在线自动稀释用旁通流路的影响,各药物在有稀释旁路下的回收率结果,(spiked 2ug/mL each),Table.,血浆样品中药物回收率,(spiked 2ug/mL each,50uLinj.),样品导入溶液,pH,值变化,对回收率的影响,样品导入溶液对回收率的影响 1,Table,血浆样品中各药物回收率结果,(spiked 0.5ug/mL each(Naproxen:2ug/mL),50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响,2,样品导入溶液,离子强度变化,对回收率的影响,Table Recovery of drugs in plasma,(spiked 0.5ug/mL each(Naproxen:2ug/mL),50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响,3,样品导入溶液,乙腈溶剂添加,对回收率的影响,出色的柱使用寿命,0,8.5,17,Time(min),0,8.5,17,Time(min),第,1,次,第,300,次,阀切换,阀切换,连续注入时的稳定性,血浆基底的洗脱,从稳定的,MAYL-ODS,洗脱蛋白质等血浆基底,峰及回收率,稳定的峰形状及回收率（几乎,100%,）,样品,：,添加异丙基安替比林的血浆,注入量,：,100L,样品导入液,：,0.1%,磷酸水溶液乙腈混合液,稀释倍数,：,8,倍,检测,：,分析；,275nm,，,血浆基质,；,280nm,Co-Sense for BA-LCMS,系统的特长,通过在,Co-Sense for BA,系统上连接,LCMS-2010EV,，,成为更强有力的生物样品分析系统,LCMS,所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力,。,何种化合物可用,LC/MS,分析,?,取决于化合物的离子化效率；,化合物分子自身的极性，结构及其所含的功能基团等因素均会影响离子化情况；,多数具有一定极性的有机化合物可以通过,ESI,或,APCI,的方式离子化，如,:,药物及其代谢产物,天然产物,(,生物碱,配糖物、苷,glycosides,taxanes,毒素,糖类,脂类,维生素等等,),蛋白质，多肽；,杀虫剂，除草剂,表面活性剂和染料,LC/MS,的优势,强大的定性和选择性能力,多组份样品的准确定性；,未充分分离组份峰的鉴别；,消除杂质干扰；,可作为便捷的定性分析,用于合成和衍生反应的研究,；,作,NMR,预分析的质谱鉴定；,广泛适用于难挥发性化合物的分析,扩展了大气压离子化,的多种应用,对液相色谱分离组份进行强有力的定性确证,M/Z,M/Z,M/Z,TIC,色谱图,质谱图,强大的选择性,A:100,D:150,B:100,C:150,m/z=150,TIC,m/z=100,A,B,C,D,未充分分离峰的鉴别,椰子油的分析,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,min,0e6,10e6,20e6,30e6,40e6,50e6,60e6,Int.,三烷基甘油用反相,HPLC,方式分离，洗脱次序基于同系物的炭数,ECN=CN-2 x DB,Elution order is based on equivalent carbon number,m/z 439.5:C38 DB=0,m/z 467.5:C40 DB=1,m/z 495.5:C42 DB=2,m/z 523.5:C44 DB=3,TIC,高效液相色谱,HPLC,与质谱,MS,的接口技术研究始于,1970s,;,大气压下的离子化,API(atmospheric pressure ionization),于,1987,年商品化。,大气压下的离子化接口,:,电喷雾离子化,E,lectrospray,ionization,(ESI)；,大气压下化学离子化,Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI),；,大气压下光离子化,Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI),LC/MS,离子化接口,高效液相,HPLC,质谱,MS,离子化接口,含缓冲盐的水,/,有机相；,非挥发性的流动相,Non-volatile,高真空状态,分析离子（,m/z）,去除液相色谱导入的溶剂,将待分析物离子化,关键技术,大气压状态,低真空区域,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,机械泵,涡沦分子泵,TMP1,涡沦分子泵,TMP2,MS,质量分析器,高真空区域,LC/MS,系统硬件主要构造,离子源,离子化接口,大气压下的离子化,API,方法的优势,电喷雾,Electrospray(ESI,),适于极性样品的分析；,推荐使用半微量流速，在雾化气条件下,LC,可实现高至,1,ml/min,的流速,；,用该种离子源能形成多电荷离子,，,扩展了所能检测的分子量范围；,大气压下化学电离,Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI),低极性化合物；,推荐使用半微量流速，在雾化气条件下,LC,流速可实现高,至,2,ml/min；,比热喷雾具有更好的稳定性；,大气压下光电离,Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI),弱极性和非极性化合物,直接,APPI,离子化及掺杂物,APPI,离子化方式的正确选择,LCMS,2010EV,仪器结构特点,-,干燥气体,-,保护,TMP 1,TMP 2,旋转泵,废,液管,检测器,四极杆,前杆,入口镜,聚焦镜,八极,Q-,阵,列,Skimmer,保护阀,来自,LC,雾化,气体,ESI,或,APCI,或,APPI,源,CDL,干燥气体,岛津,QoQ,设计,允许流速：,0.0011 ml/min,；,操作温度：室温；,雾化气流速,N,2,：,1.5 L/min,高电压,雾化气,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,+,+,-,-,+,-,+,+,+,-,+,-,+,-,+,+,+,-,+,-,+,+,+,+,+,+,大气压下的离子化(,API),原理,电喷雾离子化,ESI,ESI,液相流出组份,1)带电液滴,2),溶剂蒸发,3)离子蒸发,大气压下的离子化(,API),原理,大气压下化学离子化,(,APCI),高压放电针,离子,-,分子反应,允许流速：,0.05 2 ml/min,加热模块:,400,o,C,雾化气流速,N,2,：,2.5 L/min,APCI,液相流出组份,雾化气,大气压下的离子化大气压下化学离子化(,APCI),LC,流份在雾化气作用下进入加热模块；,流动相蒸发；,高压放电条件下,，,质子化溶剂被离子化,(,产生反应离子,),；,4),样品和已产生的反应离子发生离子-分子反应生成质子化分子,离子,-,分子反应,Schematic diagram of APPI,CDL,UV,Lamp,Heater,Nebulizer,Gas,From,HPLC,ESI,APCI,APPI,polarity,Very polar,nonpolar,Molecular Weight,10,000,1,000,100,正离子或负离子模式采集数据,?,质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和特性等,由于,C-O、C-N、,双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子,；,含,COOH,-F,-,Cl,-HSO,3,的偏酸性化合物由于具有较强的质子给予能力，更倾向于形成负离子,；,还有许多化合物既可形成正离子，也能生成负离子；,LC/MS 2010,EV,的硬件结构,正交设计的离子源,加热的毛细管,Q-array,八极杆,Octapole,四极杆质量分析器,检测器,离子转移,质量过滤,CDL,(Curved,Desolvation,Line),单元和,QoQ,系统,加热模块,Block Heater,端口,Tip,废液孔,CDL,单元,Q-array Q-,阵列,八极杆透镜,Qctopole,四极杆,Quadrupole,Q-,阵列,侧面,八极杆透镜,四极杆侧面,QoQ,系统是一套包含,Q-,阵列,(,Q-array),+,八极杆透镜,(,Qctopole,lens),+,四极杆,(,Quadrupole,),。,这套离子光学系统是岛津公司集,30,年质谱设计、生产经验的结果，具有优异的离子传输和离子会聚性能,。,QoQ,系统介绍,Q-array,（,Q-,阵列）,三排四极板平行排列，形成一锥形区域，使离子能被有效地引入八极杆。,Octopole Lens,（,八极杆透镜）,八极杆透镜实现稳定的离子会聚,不易受系统真空变化的影响。,Quadrupole,（,四极杆）,带有预杆的钼制双曲线四极杆系统作为,质量过滤器。预杆保护主四极杆免受污染，并延长使用寿命。岛津公司多年来,不断改进、优化,四极杆系统的性能,最终实现优异的离子传输效率，质量数的稳定性和峰形。,Q,Q,O,Q-array,中离子轨道示意图,上图显示具有不同入射角度的离子集穿过,Q-array,的轨迹,。,离子的运行路线被校正后,，,汇聚在中心的,S,kimmer,入口处,。,这一离子运行轨道是依据,Optdesign,模型（岛津研发中心）计算优化得到的。,各种方向运动矢,量的离子集,通过,Q-array,后的离子集，经会聚作用具有同一矢量,三排四极板成锥形平行排列，使离子被会聚于一狭窄区域。,这与具有高频电压的四极杆工作原理类似。,锥形设计提高了离子会聚能力，这也是提高灵敏度的关键。,Performance of the Q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.,典型的,LC/MS,质谱图,50,100,150,200,250,300,350,400,450,m/z,0,e3,50,e3,100,e3,150,e3,200,e3,250,e3,300,e3,350,e3,Int.,185,197,207,227,391,105,295,167,257,142,268,317,425,280,369,128,155,243,404,341,497,66,82,469,453,57,482,APCI,正离子模式,APCI,负离子模式,Co-Sense for BA-LCM,S,分析血浆样品,通过在,Co-Sense for BA,系统上连接,LCMS-2010EV,，,成为更强有力的生物样品分析系统,LCMS,所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力,。,分析条件,1:,倍他乐克,m/z 268,2:,普萘洛尔,m/z 260,3:,利多卡因,m/z 235,4:,狄布卡因,m/z 344,5:,布比卡因,m/z 289,1,2,3,4,5,1,m,g/mL each,5,m,L,SIM chromatograms of standards,each 1ug/mL,5uL,重现性,标准,血浆中的药物,倍他乐克,95.0%,普萘洛尔,97.4%,利多卡因,94.0%,狄布卡因,107.7%,布比卡因,97.1%,each 1ug/mL,5uL,n=5,回收率,1,:,倍他乐克,r=0.99954,2,:,普萘洛尔,r=0.99958,3,:,利多卡因,r=0.99981,4,:,狄布卡因,r=0.99978,5,:,布比卡因,r=0.99986,0.01,1ug/mL,10uL,n=5,plasma spiked,1,2,3,4,5,校正曲线,提取液中含乙腈对回收率的影响,a.,提取液,:10mM,乙酸铵,/,乙腈,=95/5,b.,提取液,:10mM,醋酸铵,耐用性,(Chromatogram),1st run,101st run,201st run,301st run,0,.1,m,g/mL each,plasma spiked,Injection volume:50,m,L,Extraction time:2min,Column,pressure,at start,time,(MPa),Number of Injection,耐用性,(,柱压,),Pump C for,pretreatment,色谱柱,:,Shim-pack,VP-ODS,（,2.0mmi.d.,150mmL,）,流动相,:0.1%,三氟醋酸,/,乙睛,(8/2),流速：,0.2mL/min,导入液,:10mM,醋酸铵,LCMS,与,UV,的比较,-,利多卡因的分析,-,样品,:,添加利多卡因的血清（,1mg/L,）,前处理柱：,Shim-pack MAYI-ODS,(4.6mmID,10mmL),导入液：,10mM,醋酸铵,注入量：,10mL,样品导入液流量：,1mL/min,稀释倍数：,8,倍,UV 230nm,利多卡因,利多卡因,ESI(+)SIM m/z 235,利多卡因的分析,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,min,500e3,750e3,1000e3,1250e3,1500e3,1750e3,2000e3,2250e3,Int.,TIC,100,150,200,250,300,350,m/z,0e3,250e3,500e3,750e3,Int.,235,M+H,+,0.1%,三氟乙酸,/,乙腈,=8/2,ESI(+),(1 mg/L),標準試料,注入量：,2mL,导入液,:10mM,醋酸铵,线性关系,0,250,500,750,Conc,Area,r=0.9996,(,m,g/L),分析条件,：,前处理柱：,Shim-pack MAYI-ODS(4.6mmID,10mmL),导入液：,10mM,醋酸铵,注入量：,10mL,样品导入液流量：,1mL/min,稀释倍数：,8,倍,样品浓度范围,0.01,0.1,1.0mg/L,相关系数,0.9996,检测：,LCMS-ESI-(+),利多卡因,重现精度,0.0 5.0 10.0 15.0 20.0,min,1,2,3,4,5,系统,保留时间,RSD,面积,RSD,BA-LCMS,0.13%,2.99%,通常,LCMS,0.18%,1.16%,利多卡因,標準試料（,1 mg/L,）,10,ml,分析条件：,前处理柱：,Shim-pack MAYI-ODS,(4.6mmID,10mmL),导入液：,10mM,醋酸铵,注入量：,10mL,样品导入液流量：,1mL/min,稀释倍数：,8,倍,色谱柱,:,Shim-pack,VP-ODS,（,2.0mmi.d.,150mmL,）,流动相,:0.1%,三氟醋酸,/,乙睛,(8/2),流速：,0.2mL/min,导入液,:10mM,醋酸铵,LCMS-ESI-(+),Co-Sense for BA,MAYI-ODS,柱的总结,高通用性,通过采用在线稀释旁通，可广泛地对应蛋白结合率高的药物,有效地除去蛋白质,采用新开发的涂覆技术，实现稳定有效的除蛋白,经久耐用,通过粒子径的最佳化，提供长期可靠的数据,与,LCMS,连接，更强有力的生物样品分析系统诞生,MS,强化药物鉴定功能,Thank you for your attention!,谢谢,！,