超速离心-高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,超速离心,-,高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白,和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法,董军 国汉邦 陈文祥,卫生部老年医学研究所,HDL-C,降低,和,LDL-C,升高，是明确的心血管病独立危险因素,心血管病防治工作需要准确的,HDL-C,和,LDL-C,测定结果,建立和保证,HDL-C,和,LDL-C,常规测定结果的准确性需要 可靠的参考方法,HDL-C,和,LDL-C,准确测定 必要性,美国疾病控制与预防中心,(,CDC),定量法,D=1.006,超速离心分离极低密度脂蛋白（,VLDL,），,制备底部组分（,BF,）,(,包括,IDL,LDL,HDL,和,Lp,(a),等）,用肝素,-,锰离子试剂沉淀,BF,中的,脂蛋白，制备,HDL,组分,分别用,AK,胆固醇参考方法测定,BF,胆固醇,(,BFC),和,HDLC,，,自,BFC,中减去,HDLC,得,LDL-C(,包括,IDL,和,Lp,(a),样品量大,(5,mL,),，,其应用受到可得样品量限制,LDL,和,HDL,的分离采用化学沉淀法，影响因素较多,样品制备需多部手工容量操作，费时，技术要求高,受超速离心转头品种的限制，每次分析最多,18,个样品,由于脂蛋白的不稳定性，样品制备过程（约需,24-28,小时）,本身造成,HDL-C,和,LDL-C,的变化,-,定量法存在的问题,血清脂蛋白胆固醇的体外再分布,超速离心法,:,各类脂蛋白的定义方法，在分析化学上可能,也是最可靠的脂蛋白分离方法，是一种物理分离方法，,影响因素最少。,电泳法,:,很难用于精密脂蛋白分析。,沉淀法,:,沉淀剂和沉淀条件多种多样，影响因素多，,较难实现一致的特异性。,脂蛋白的分离方法,超速离心中的定量操作困难、繁琐，样品量大,部分,Lp,(a),在,HDL,密度范围内，造成,HDL,测定偏差,超速离心法（结合精密胆固醇分析）参考方法,血清脂蛋白的密度分布,LDL,HDL,VLDL,Lp,(a),Lp,(a),是二硫键连接的,LDL-,apo,(a),复和体，还原剂,可使,Lp,(a),解离为,LDL,Lp,(a-),和,apo,(a).,Lp,(a-),密度与,LDL,相近，或略小于,LDL.,若能建立条件，使,Lp,(a),解离，又不改变,HDL,的密度,性质，则可实现,HDL,的超速离心分离,.,Lp,(a)LDL-,apo,(a),复合体,不同密度下,ME,对超速离心,BFC,的影响,ME,对血清脂蛋白密度的影响,样品溶液中,ME,浓度对,1.063,密度下超速离心,BFC,的影响,取来自不同个体的血清,49,份,在,1.063,背景密度及,ME,（,0.05 mol/L,）,存在和不存在下 超速离心，测定,BFC,（,BFC,1.063ME(+),和,BFC,1.063ME(-),）,用免疫比浊法测定,Lp,(a),质量,用,DCM,测定,HDLC,（,HDLC,DCM,）,ME,解离,Lp,(a),有效性,BFC,1.063ME(-),与,BFC,1.063ME(+),之差与,Lp,(a),的关系,(,r=0.848),BFC,1.063ME(-),与,BFC,1.063ME(+),之差与,HDLC,的关系,(,r=0.093,),BFC,1.063ME(+),与,HDLC,DCM,之差与,Lp,(a),的关系,（,r=0.414,P0.05,）,用,ME,使,Lp,(a),解离为游离,apo,(a),和,Lp,(a),Lp,(a-),用脯氨酸解离,Lp,(a),或,apo,(a),与脂蛋白的可能非共价键结合,1.063,密度下超速离心，将,HDL,（,BF,1.063,）,与其他脂蛋白分离,1.006,密度下超速离心，将,HDL,和,LDL,（,BF,1.006,）与,VLDL,分离,用,HPLC,测定,BFC,1.006,和,BFC,1.063,HDLC=BFC,1.063,LDLC=BFC,1.006,-BFC,1.063,(,含,IDLC,和,Lp,(a)C),方法原理,超速离心密度液配制,:,密度液,I:,含,0.1,M,脯氨酸的溴化钠溶液，使密度为,1.006,密度液,II:,含,0.1,脯氨酸和,0.05,M,ME,的溴化钠溶液，调节溴,化钠浓度，使密度为,1.0666,(,两种密度液（,0.8,ml,）,与血清（,0.05,ml,）,混合,后分别给出背景密度,1.006,g/ml,和,1.063,g/ml),标准溶液和内标溶液配制,:,胆固醇乙醇溶液,:,浓度,0.646,1.293,2.586,5.172,7.758,mmol,/L,豆甾醇乙醇溶液,:,浓度,5.17,mmol,/L,，,作内标溶液,密度液及标准溶液配制,样品制备,:,用稀释器的稀释功能加入血清样品,(,体积为,0.05,ml),和,稀释剂（密度液,体积为,0.8,ml),超速离心条件,:20,23000,rpm,离心,18.5,h,离心管切割,:,用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管，取下部 离心管，内含,1.006,g/ml,背景密度下的,BF,（,BF,1.006,）,和,1.063,g/ml,背景密度及,ME,存在下的,BF,（,BF,1.063,），,进行胆固醇分析,HDLC=BFC,1.063,LDLC=BFC,1.006,-BFC,1.063,超速离心分离脂蛋白组分,高效液相色谱测定胆固醇,I,将内含不同,BF,的下部离心管，置,10-,ml,具盖试管中,标准溶液,0.05,ml,，,用,0.5,ml,乙醇冲入,10-,ml,具盖试管中,向各试管中加乙醇,-8.9,mol/L,氢氧化钾（,9:1,）,4,ml,各管加内标,0.05,ml,，,用,0.5,ml,乙醇冲入,10-,ml,具盖试管中,水平式振荡器振荡,20,min,50,水解,2,h,高效液相色谱测定胆固醇,II,400ul Acetone,20,l,4MH2SO4-4MCrO3,vortex,RT 5min,0.5,ml Hexane,0.5ml water,Vortex,5min,200,ul,supernatant dry down for chromatography,0.5,ml,水解液,0.5,mlH2O,1mlHexane,Vortex,20min,0.5,ml,Hexane,挥干,高效液相色谱分离胆固醇和,6-,氯豆甾醇,超速离心法,HDLC(,BFC,1.063ME(+),),与,HDLC,DCM,的关系,(,r=0.998),血清 平均值,(,mmol,/L),平均批内,CV(%),总,CV(%),HDLC,LDLC HDLC,LDLC,HDLC LDLC,1.342 2.897 0.67 0.48 0.96 1.12,2.202 2.778 0.60 0.78 1.01 0.92,1.292 4.148 0.91 0.45 1.73 0.65,0.880 2.874 1.21 0.68 2.07 0.82,超速离心,HPLC,法测定血清,HDLC,和,LDLC,的精密度,用超速离心法分离脂蛋白，所分离的脂蛋白与应用最广泛的脂蛋白定义一致，,HDL,不受,Lp,(a),污染,分离过程影响因素少,所需样品量小（,0.1,ml,），,且一次可分析,50,个样品,用稀释器代替手工容量操作,操作简便，精密度良好,可以测定脂蛋白亚类,本法可望用作,HDLC,和,LDLC,参考方法,HDLC,和,LDLC,准确测定方法,