氨基酸含量的测定-茚三酮比色法.ppt

实验九 氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）,1.,实验原理,凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生,紫色化合物,，最大吸收波长在,570nm,处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。,氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：,2.,实验材料、仪器与试剂,材料：,酱油,仪器：,可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。,试剂：,茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。,3.,实验步骤,（1）样品的处理：,准确吸取0.5mL酱油于100mL烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。,各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴,15min,，取出冷却至室温后加水至,10mL,刻度线，静置,15min,后，在,570nm,处测定吸光度，以氨基酸含量,(,g,),为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。,（,2,）标准曲线的绘制,管号,1,2,3,4,5,6,7,氨基酸标准溶液,/,mL,0,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,水,/,mL,1.6,1.1,1.0,0.9,0.8,0.7,0.6,磷酸盐缓冲液,/,mL,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,茚三酮,/,mL,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,0.4,氨基酸含量,/,g,0,100,120,140,160,180,200,按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。,（,3,）样品测定,管号,8,9,10,11,样品溶液,/,mL,0,0.5,0.5,0.5,水,/,mL,1.6,1.1,1.1,1.1,磷酸盐缓冲液,/,mL,0.4,0.4,0.4,0.4,茚三酮,/,mL,0.4,0.4,0.4,0.4,4.,结果计算,5.,说明及注意事项,（,1,）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达,0.5g,，其其灵敏度高，重现性好。,（,2,）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在,440nm,处。,（,3,）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品,5g,10g,或吸取液体样品,5mL,10mL,，置于烧杯中，加入,50mL,蒸馏水和,5g,左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用,30mL,40mL,热水洗涤活性炭，收集滤液于,100mL,容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。,6.,思考题,（,1,）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？,（,2,）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点各是什么？,