分解纤维素的微生物的分离(原创).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六级,第七级,第八级,*,分解纤维素的微生物的分离,岳池一中 荣启余,阅读课本27页基础知识部分第一、二段，回答下列问题,：,1、纤维素在生物圈的分布状况？,2、纤维素酶的组成及作用？,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中,棉花,是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即,C,X,酶,、,C,1,酶,和,葡萄糖苷酶,，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,一、纤维素和纤维素酶,草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？,肠胃中的共生,微,生物。除自然环境中存在分解纤维素的微生物外，在草食性动物等的消化道内，也共生有,分解纤维素的微生物,，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。,底物：酶所作用和催化的化合物。,试管,A,B,滤纸条,1cm x 6cm,1cm x 6cm,缓冲液,10ml,11ml,纤维素酶,1ml,/,振动,1h,1h,现象,分解,不分解,纤维素酶的作用对照实验,二、纤维素分解菌的筛选,阅读课本课本28页相关部分，回答下列问题：,1、纤维素分解菌的筛选方法,2、纤维素分解菌的筛选方法的原理,刚果红染色法,：,这种方法能够通过颜色反应直接 对微生物进行筛选,(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,(2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。,实验原理,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,三、实验操作,土壤取样,选择,培养*,梯度稀释,将样品涂布到,鉴别,纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致.,本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同,？,土壤取样,取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？,选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境,为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？,将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境。,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。,选择培养,培养基组成,提供主要的营养物质,纤维素粉 5g,碳源（能源）,NaNO,3,1g,氮源、无机盐,KCl 0.5g Na,2,HPO,4,7H,2,O 1.2g,KH,2,PO,4,0.9g MgSO,4,7H,2,O,0.5g,无机盐,酵母膏 0.5g,生长因子、碳源、氮源,水解酪素 0.5g,氮素、生长因子,溶解后，蒸馏水定容至1000mL,水,1、选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物,2、制备选择培养基,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题,a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具 有，是如何进行选择的？,c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的 微生物可以大量繁殖,用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,选择培养,3、操作方法：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1,2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养,思考：,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用,刚果红染色法,方法一：,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：,在倒平板时就加入刚果红,思考：,这两种方法各有哪些优点与不足？,培养基组成,提供的主要营养物质,CMC-Na 510g,碳源,酵母膏 1g,碳源、氮源、生长因子,KH,2,PO,4,0.25g,无机盐,土豆汁 100mL,碳源、生长因子,琼脂 15g,凝固剂,上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL,氢元素、氧元素,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),方法一：,方法二：,步骤,培养基经涂布培养,先,长出菌落,再,覆盖1mg/mL的CR溶液(1015min后)倒去CR溶液加入1mol/L的NaCl溶液15min后倒掉NaCl溶液出现透明圈,配置10mg/mL的CR溶液灭菌按照1mLCR溶液/200mL培养基的比例,混匀,倒平板接种后培养出现透明圈,优点,显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用,操作简便，不存在菌落的混杂问题,缺点,操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂,由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。,有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。,两种刚果红染色法的比较,：,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,梯度稀释,按照课题1的稀释操作方法，将选择培,养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数,到10,6,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,1、制备培养基,:,参照旁栏中的比例,2、涂布平板：将稀释度为10,4,10,6,的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养,挑选产生透明圈的菌落,参照课本,刚果红染色法,，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落,四、结果分析与评价,（,一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落,（二）分离的结果是否一致,设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,如果不同，分析产生不同结果的原因。,由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,五、课题延伸,本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。,31为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行,发酵产纤维素酶,实验，纤维素酶的发酵方法有,液体,发酵和,固体,发酵。,32纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的,葡萄糖,含量进行定量测定。,练一练,1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（）,A、生物结构与功能相适应的观点 B、生物结构与功能整体性观点,C、生物与环境相适应的观点 D、生物发展进化的观点,2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（）,土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落,A、B、,C、D、,3、有关选择培养正确的叙述是（）,A、可以增加纤维素分解菌的浓度,B、可以减少纤维素分解菌的浓度,C、所用培养基是固体培养基,D、所用培养基是平板培养基,C,B,A,纤维素分解微生物的分,离,纤维素酶,种类、作用、最适pH、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法,后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课题总结、点评,再见,