实验九、等电聚焦电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点,一、目的要求,1.,学习和掌握圆盘电泳技术,2.,学习和掌握,等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法,二、原理,聚丙烯酰胺等电聚焦电泳,(,Isoelectric,Focusing-PAGE,，,简称,IEF-PAGE),：,利用各种蛋白质,pI,不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体,(carrier,ampholytes,),，,两性电解质载体在电场作用下，按各自,pI,形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的,pH,梯度。在电场作用下，蛋白质在此,pH,梯度凝胶中泳动，当迁移至,pH,值等于,pI,处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,两性电解质载体,(carrier,ampholytes,),(1),易溶于水，在,pI,处应有足够的缓冲能力，形成稳定的,pH,梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变,pH,梯度。,(2),在,pI,处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。,(3),分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。,(4),化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。,IEF-PAGE,分离蛋白质并测定,pI,图,3.6,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图,(A,为正面,B,为剖面,),(1),样品胶,pH6.7 (2),浓缩胶,pH6.7 (3),分离胶,pH8.9 (4),电极缓冲液,pH8.3,三、试剂与器材,试剂：两性电解质载体,pH 3-10,、,10%,四甲基乙二胺、,10%,过硫酸铵、,5%H,3,PO,4,、,2%NaOH,、,40%,蔗糖、,0.04,考马斯亮兰,R250,、,7%,醋酸,器材：圆盘电泳槽、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床,四、操作方法,1.,凝胶柱的制备,（,1,）玻璃管的一端插在橡皮帽中,(,与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴,40%,的蔗糖,),（,2,）配胶,表,10mL 7.5%,凝胶的配制,试 剂 名 称 体积,(,mL,),凝胶贮液,2.5,两性电解质载体,0.5,10%TEMED 0.1,蛋白质混合样品,0.1,蒸馏水,6.75,混匀后置真空干燥器中抽气,10 min,10%,过硫酸铵,0.05,（,3,）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，,至离上端,1 cm,处,，再用注射器缓缓加水,3-5 mm,高。,（,4,）待凝胶聚合,2.,电泳,小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中,（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）,在上槽中加入,5%,磷酸缓冲液，在下槽中装入,2%,氢氧化钠溶液。,避免管下有气泡,。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至,100 V,，,待电压稳定后再升到,300 V,，,电泳,2 h,以上至电流降为,0,，将电压调至,0,，关闭电源。,3,剥胶,电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，,在凝胶条的正极端插一铜丝为标记,。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。,4.,固定染色,取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色,1-2 h,，,用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,5.pH,梯度的制作,取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每隔,0.5 cm,切下一段，依次放入已编好号并装有,1,mL,蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的,pH,值。以凝胶长度为横坐标，,pH,值为纵坐标，绘制标准,pH,梯度曲线。,6.,蛋白质样品等电点的计算,求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：,固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离,固定染色前凝胶条长度,固定染色后凝胶条长度,计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从,pH,梯度曲线上求出该蛋白质等电点。,五、注意事项,盐离子可干扰,pH,梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行,IEF-PAGE,时，样品应透析或用,SephadexG-25,脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。,加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝,R-250,染色，加样量可为,50-150,g,；,如用银染色，加样量可减少到,1,g,。,一般样品浓度以,0.5-3 mg/,mL,为宜，最适当加样体积为,10-30,l,。,六、思考题,(1),简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。,(2),进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？,