第三章 提取和分离.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章,DNA,的提取与纯化,基因工程需要三种不同的,DNA:,总,DNA,质粒,DNA,噬菌体,DNA,学习内容：,制备细胞总,DNA,培养、搜集细菌细胞,制备细胞提取物,DNA,纯化、浓缩,从其他生物中提取总,DNA,质粒,DNA,提取,根据分子大小分离,根据结构分离,质粒扩增,提取噬菌体,DNA,噬菌体的培养,制备非溶源性噬菌体,收集噬菌体,从,噬菌体中纯化,DNA,纯化,M13 DNA,Figure3.1,The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteria,Basic Steps,1.,制备总,DNA,基本步骤：,1),收集细菌细胞,2),打碎细胞，释放内容物,3),去掉,DNA,以外的成分,4)DNA,溶液的浓缩,1.1,培养、搜集细菌细胞,两种类型的细菌培养基的成分：,M9,培养基：,Na,2,HPO,4,(6.0)KH,2,PO,4,(3.0)NaCl(0.5)NH,4,Cl(1.0)MgSO,4,(0.5)Glucose(2.0)CaCl,2,(0.015),LB,培养基：,Yeast,extract(5)NaCl(10),1.1,培养、收集细菌细胞,37C,，,150-250rpm,达到最大浓度,2-310,9,cell/ml,600nm,下的,OD,值，,1OD,相当于,0.810,9,cell/ml,Figure3.2 Estimation of bacterial cell number by measurement of optical density,Figure3.3,Harvesting bacteria by centrifugation,1.2,制备细胞提取物,利用溶菌酶、,EDTA,或两者结合。,溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。,EDTA,络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解,DNA,酶的活性。,一般溶菌酶或,EDTA,足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入,SDS,。,Figure3.4,Preparation of a cell extract.,Preparation of a cell extract,Figure3.5,Removal of protein contaminants by phenol extraction.,Purification of DNA from a cell extract,1.,制备细胞总,DNA,1.4 DNA,的浓缩与浓度测定,最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有,Na,离子）。,DNA,沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。,260nm,下测定吸光度，,1OD,相当于,50,g,双链,DNA/ml,。,A,260,/A,280,=1.8,，,2,说明有,RNA,Figure3.6,Collecting DNA by ethanol precipitation.,Concentration of DNA samples,Figure3.7,The CTAB method for purification of plant DNA,Plant DNA(CTAB,法,),十六,烷基三甲基溴化铵,Figure3.8,The use of an anion-exchange chromatography resin in DNA purification.,阴离子交换层析法,2,质粒,DNA,提取,质粒,DNA,的大小（,8%,）。,DNA,的构造,Alkaline,denaturation,Ethidium,bromide,（溴化二氨乙苯啡啶）,-,caesium,chloride,（氯化铯）,density gradient centrifugation,2,质粒,DNA,提取,2.1,根据分子大小提取质粒,DNA,sphaeroplasts,裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。,问题：,裂解液中不可避免的包含一些染色体,DNA,质粒分子非常大时，将与染色体,DNA,共沉淀,Figure3.9 Preparation of a cleared,lysate,.,Sphaeroplast,残壁,细胞,2,质粒,DNA,提取,2.2,根据分子构造提取,碱裂解法,基本原理：在非常窄的,pH,范围内，非螺旋化的,DNA,会变性，而螺旋化的质粒不变性。在裂解液中加入氢氧化钠，调,pH,值至,12.012.5,破坏氢键，使,DNA,变性。加入酸，变性的细菌,DNA,进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。另外一个优点，利用,SDS,（十二烷基磺酸钠）（,Sodium dodecyl sulfate,，,SDS,），裂解，,KAc,中和可以去掉大部分的蛋白质和,RNA,。,Figure3.10,Two conformation of circular double-stranded DNA.,Two conformation of circular double-stranded DNA,Figure3.11,Plasmid purification by the alkaline,denaturation,method.,Alkaline,denaturation,2,质粒,DNA,提取,2.2 EB,CsCl,密度梯度离心法,在大离心力条件下，形成梯度，生物大分子形成条带。条带的位置取决于其浮力密度。最上部是蛋白质，中间是,DNA,，下部是,RNA,。,Figure3.12,CsCl,density gradient centrifugation.,CsCl,density gradient centrifugation,2.2 EB,CsCl,密度梯度离心法,EB,插入相邻的碱基之间，降低了,DNA,的浮力密度，但超螺旋的,DNA,结合,EB,浮力密度降低较小，仅有,0.085g/cm,3,。,CsCl,可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达,100%,。,Figure3.13,Partial unwinding of the DNA double helix by,EtBr,intercalation between adjacent base,parirs,.,EB,EB,如何与,DNA,结合,?,Figure3.14,Purification of,plasmiod,DNA by,EtBr-CsCl,density gradient centrifugation,如何分离质粒,DNA,？,2,质粒,DNA,提取,2.3,质粒扩增,一些多拷贝质粒具有在无蛋白合成条件下复制的能力。当细胞增加到足够数目时，加入蛋白合成抑制剂如,氯霉素,，继续培养。在这个过程中，质粒分子继续复制，但染色体的复制和细胞分裂已经停止，可以获得上千个拷贝。,Figure3.15,Plasmid amplification,Plasmid amplification,Inhibitor of protein synthesis:,Chloramphenical,12h,3,噬菌体,DNA,的制备,当培养物离心时，细菌沉淀到底部，噬菌体留在悬浮液中，去蛋白就可以获得噬菌体,DNA,。然而获得大量的噬菌体,DNA,是一个障碍。每,ml,菌液可以获得,10,10,噬菌体，但只能产生,500ngDNA,。,3,噬菌体,DNA,的制备,3.1,噬菌体的培养,自然培养的噬菌体是溶源性的。要获得大量的细胞外,噬菌体，必须经过诱导培养使所有的,噬菌体都进入裂解周期，使细胞死亡释放,噬菌体。,3.1,噬菌体的培养,大部分实验室都使用,c,I,突变的温度敏感突变体。,c,I,基因可以使噬菌体保持整合状态，突变后转变成溶菌性的。在,c,I,ts,突变体中，,c,I,基因在,30C,条件下正常表达，在,42C,时，不能正常表达，产生溶菌性。,Figure3.17,Induction of a,clts,lysogen,（溶原菌）,by transferring from 30 to 42,Lysogenic,phage,At 30,clts,gene protein works,Keep,lysogeny,（溶原性）,:,At 42,clts,gene protein does not work,produce,extracellular,phage,（细胞外抗菌素）,.,Figure3.18,Achieving the right balance between culture age and,inoculum,size when preparing a sample of a non-,lysogenic,phage,Non-,lysogenic,phage,（,Lytic,),由于缺失修饰，大多数基因工程载体属于此类型。,3,噬菌体,DNA,的制备,3.3,收集噬菌体,噬菌体颗粒非常小，所以只有高速离心才能沉淀。通常利用,PEG,沉淀病毒颗粒，形成多聚体。离心可以收集,噬菌体，重新溶解在少量的溶液中。,3,噬菌体,DNA,的制备,3.4,从,噬菌体中纯化,DNA,PEG,沉淀物中可能含有少量的细菌裂解物，也可能含有细菌,DNA,。这些组成部分可以通过梯度离心去掉。除去,CsCl,后可以获得纯净的,噬菌体。然后通过酚抽提或者蛋白酶处理蛋白质外壳。,Figure3.19,Collection of phage particles by,polyethylene,（聚乙烯）,glycol,（乙二醇）,(,PEG)precipitation,Collection of phage particles,Purification,of phage,Figure3.20,Purification of phage particles by,CsCl,density gradient centrifugation.,3.5,纯化,M13 DNA,每,ml,菌液可以获得,10,12,的噬菌体。这意味着少量的培养物可以获得大量的噬菌体，如,5ml,或更少。,由于细菌细胞不裂解，没有细胞裂解物的问题，也不需要,CsCl,梯度离心。,Figure3.21,Preparation of M13 DNA from an infected culture of bacteria.,Preparation,of M13 DNA,Next chap,Next Chap,中国基因工程研究进展,*,The end,！,Thanks,！,测验一,根据你的理解，回答以下三个问题。,1,、什么是基因工程技术？基因工程的意义何在？,2,、简要说明基因工程研究的基本步骤？,3,、谈谈你对基因工程技术未来的发展趋势及构想。,