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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 4.,蛋白质的结构与功能,蛋白质的构象不是刚性的、静止的，而是柔性的、动态的。蛋白质在执行其生物学功能的时候，总是与其它分子相互作用从而使其构象发生改变。在蛋白质与其它分子的相互作用中，能够与蛋白质可逆结合的分子称为配体，配体可以是任何一种分子。,蛋白质配体的相互作用的瞬时性对于生命至关重要，它允许生物体在内、外环境发生变化时，能够快速、可逆地作出反应。蛋白质上的配体结合部位和配体在大小、形状、电荷以及疏水和亲水性性质方面是互补的。,本章的主要内容：,肌红蛋白的结构与功能,血红蛋白的结构与功能,免疫球蛋白的结构与功能,4.1 肌红蛋白的结构与功能,肌红蛋白（,myoglobin,Mb）,是哺乳动物细胞、主要是肌细胞贮存和分配氧的蛋白质。,4.1.1 肌红蛋白的三级结构,肌红蛋白是由一条多肽链和一个辅基血红素构成，相对分子质量为16,700,，含153个,Aa,。,无血红素辅基的肌红蛋白是珠蛋白,(,globin,)，,它和血红蛋白的两个亚基的构象和功能极其相似，在,Aa,序列上具有明显的同源性。,肌红蛋白分子呈扁平的菱形，分子大小约为4.5,nm,3.5nm,2.5nm，,分子中多肽的主链有长短不同的8段直的螺旋构成，这8段螺旋分别命名为,A、B、C、D、E、F、G、H，,相应的非螺旋区肽段称为,NA、AB、BCGH、HC，,个残基处有一套从,N,端开始计算的序列号外，还按在个螺旋中的位置另外给出编号。8个螺旋大体上,组装成两层，构成肌红蛋白的单结构域。拐弯处的螺旋受到破坏，拐弯是由18个,Aa,组成的无规卷曲，,C-,末端由一个5个,Aa,的松散肽段。肌红蛋白的分子十分致密结实，分子内部只有一个能容纳4个水分子的空间。,4.1.2 血红素辅基,肌红蛋白与氧的可逆结合依赖于血红素辅基。血红素辅基是由,Fe(II),和原卟啉,IX(,protopor-phyrin,IX),组成。卟啉类化合物有很强的着色能力。,原卟啉,IX,与,Fe,的络合物称为,血红素,(,heme,)。,Fe,为6配位，参与配位的,Fe,是亚铁,Fe(II,),时，血红素称为,亚铁血红素,，肌红蛋白称为亚铁肌红蛋白；参与配位的如是,Fe(III,)，,血红素就是高铁血红素，肌红蛋白是高铁肌红蛋白。,4.1.3 氧分子与肌红蛋白的结合,辅基血红素,非共价,地结合于肌红蛋白分子的疏水孔穴中,，卟啉环上的两个丙酸基伸向空穴外侧。血红素中铁的第5个配位键与肌红蛋白第93位（或,F8）,的,His（,称近侧）的咪唑,N,络合，当肌红蛋白与氧结合时，,Fe,的第6个配位被氧原子占据。,在去氧肌红蛋白中，,Fe,的第6配位空置，在高,Fe,肌红蛋白中，该配位被水占据。,在血红素的氧结合部位一侧，还有一个,His,残基，称为,远侧组氨酸,（,E7），HisE7,虽不与,Fe,发生作用，但与氧原子能紧密接触。这样，,氧结合部位实际上是一个空间位阻区域，使得,Fe-O,键虽然垂直于卟啉环平面，但是氧轴不垂直于该平面，而是与卟啉平面成一定的角度的倾斜。,在血红素的氧结合部位一侧，还有另一个,His，64,位（,E7），,称远侧,His，,它能与氧分子紧密接触形成一个空间位阻区域。被结合的,O,2,夹在远侧,His,残基和,Fe(II),原子之间。这种空间位阻区域有利于肌红蛋白和血红蛋白有效地降低血红素对于,CO,的亲合力。,A.,氧合肌红蛋白,B.,Mb:CO,复合物,游离血红素,CO:,咪唑复合物,血红素的氧结合部位是一个空间位阻的区域，也相对的是一个疏水环境的区域，这样,能够有效地抑制氧分子对,Fe(II),的氧化，有效地降低肌红蛋白对,CO,的亲合力。,结合着,Fe(II),的血红素位于肌红蛋白和血红蛋白的疏水孔穴中，,Fe(II),不易被氧化，当结合氧时，,Fe,会发生暂时性的电子重排，氧释放后又会回到,Fe(II),的状态。,肌红蛋白和血红蛋白的多肽微环境至少有三个作用：,固定血红素；,保护血红素面遭氧化；,为,O,2,提供一个合适的结合部位。,4.1.4,O,2,的结合改变肌红蛋白的构象,O,2,与血红素的结合使得,Fe,与卟啉环的关系发生显著的变化。在去氧肌红蛋白中,Fe（II）,只有5个配体，位于卟啉环平面上方0.055,nm，,因此,Fe,卟啉呈圆顶状或凸形。当与,O,2,结合后，,Fe(II),被拉回到卟啉环平面，,Fe,卟啉由圆顶状变成平面状。,4.1.5,肌红蛋白的氧结合曲线,Y,指在给定的氧压力下肌红蛋白的氧分数饱和度（,fractional saturation）,即氧合肌红蛋白分子数占肌红蛋白总分子数的百分数。在上面的公式引入,Y，,则会得到：,肌红蛋白的氧合曲线为一双曲线，它的两条渐近线是,Y=1,和,p,(O,2,)=-,K。,当,Y=,1，,所有肌红蛋白的氧结合部位均被氧所占据，即肌红蛋白处于氧饱和的状态。当,Y=0.5,时，,p,(O,2,)=,K,P,50,，,或,P,0.5.。,P,50,指肌红蛋白处于氧半饱和时的氧分压,。,当,Y=0.5,时，,p,(O2)=,K,P,50，,或,P,0.5.。,P,50,指肌红蛋白处于氧半饱和时的氧分压。,用,lg(,Y,/(1-,Y,),对,lg,p,(O,2,),所作的图称为,Hill,曲线,（,Hill plot）。,肌红蛋白的,Hill,曲线为一条直线。当,lg(,Y,/(1-,Y,)0，,p,(O,2,)K,P,50,。,在,lg(,Y,/(1-,Y,)0,这一点的斜率就是,Hill,系数,，以,n,H,表示。,肌红蛋白的,n,H,1.0。,4.2 血红蛋白的结构与功能,主要内容有：血红蛋白的结构、氧合过程的构象变化和别构效应。,4.2.1 血红蛋白的结构,血红蛋白由四个亚基组成，两个,和,两个,链，,一条,和,另一条,链构成血红蛋白的一个原体,。,人在不同的发育时期血红蛋白的亚基的种类是不同的，成人的血红蛋白主要是,Hb,A(,Hb,A,1,)，,其亚基组成为,2,2,。,Hb,A,1c,是,Hb,A,的葡糖基化变异形式，与血中的葡萄糖浓度相关，临床上可作为血糖控制的指标。,胎儿血红蛋白是,Hb,F，,亚基组成为,2,2。,Hb F,的,链和,链的区别只是由,-,链中的,Ser（H21）,取代了,-,链中的,His，,这样就有效地降低了,Hb,F,对,BPG（2,3-,二磷酸甘油酸）的亲合力，增高了对氧的亲和力，使得胎儿能够有效地通过胎盘从母体的血液中吸收氧。,Hb,分子的三维结构近似球形,，四个亚基占据相当于四面体的4个顶角，,Hb,分子呈,C2,对称。,4个血红素分别位于每个多肽链的,E,和,F,螺旋之间的裂隙处，并暴露于分子的表面。4个氧结合部位彼此保持一定的距离，两个最近的,Fe(II),之间的距离为2.5,nm。,两个不同的亚基之间的相互作用最大，二两个相同的链之间的作用很小。两种不同的亚基是为了获得协同性氧结合所必需的。,血红蛋白的,亚基和肌红蛋白的三级结构非常相近，但是在氨基酸组成上存在着很大的区别。,血红蛋白的两个亚基由于末端螺旋段的缺失而比肌红蛋白短,。,血红蛋白中有9个位置的残基是高度保守的，这对于血红蛋白分子的功能有着特殊的意义。,血红素的可逆作用有赖于一个非极性的微环境，这样可以避免与水接触，防止,Fe(II),被氧化成,Fe(III)。,如果,Fe(II),被氧化成,Fe(III)，,血红蛋白就相应地变成,高铁血红蛋白,，用,HbM,表示，,HbM,无载氧功能。,4.2.2 血红蛋白的构象变化,氧合作用显著改变,Hb,的四级结构,血红蛋白的,接触有两种类型：,装配接触(,packing contact)，,是,1,1,和,2,2,接触,(,构成一个原体，由两个原体装配成一个血红蛋白,),，涉计螺旋,B、G、H,和非螺旋区的,GH,拐弯的30多个残基，接触面积大，对亚基的装配很重要，但在血红蛋白与氧结合时这种接触不发生变化。,滑动接触(,sliding contact)，,是,1,2,和,2,1,接触,涉及螺旋,C,和拐弯,FG,的19个残基，当血红蛋白发生氧合作用时，这类接触会发生改变。,血红蛋白可看成是由两个相同的二聚体半分子组成,，,11-,和,22,亚基对。,每一个二聚体半分子作为一个刚体移动。如果一个二聚体固定不动，则另一个二聚体将绕设想的通过两个二聚体的偏心轴旋转约15度并且平移0.08,nm。,2.,血红素的微小移动导致血红蛋白的构象转换,氧合时血红蛋白的四级结构的变化可分为空间效应和电子效应两个方面。,空间位阻导致,Fe-N,键从垂直于血红素平面变成略有倾斜。,电子效应是由于,Fe(II),价电子层的电子排布变化引起。,血红蛋白由于血红素的位移而导致的构象变化，最终导致了维系血红蛋白四级结构链间盐桥的断裂，使得,亚基之间的空隙变窄，并且挤出,BPG,分子。,3.,血红蛋白的,T,态和,R,态两种互换的构象态,T,态,（,tension state）：,即血红蛋白的紧张态，是去氧血红蛋白的主要构象。,R,态,(,relaxed state)：,松弛态，对氧的亲合力高于,T,态，并且氧的结合能够稳定,R,态，是氧合血红蛋白的主要构象。,由于上述这些盐桥的作用，使脱氧血红蛋白分子的构象受到很大的束缚致使它对氧的亲和力远低于单独的,链、,链或肌红蛋白对氧的亲和力。,BPG,分子的插入，使得脱氧血红蛋白分子的四级结构更加固定，因而进一步降低了对氧的亲和力。,4.2.3,血红蛋白的协同性氧结合,血红蛋白结构和功能上都较肌红蛋白,(Mb),复杂：四聚体的结构；输送氧气外，还输送,H+,和二氧化碳。,血红蛋白的氧合具有正协同性同促效应，就是一个,O2,的结合增加同一分子中其余空的氧结合部位对,O2,亲和力。,Hb,氧结合曲线是,S,形的而非肌红蛋白的双曲线。,血红蛋白的解离常数和氧分数饱和度方程分别是：,曲线的,S,型特性是,O,2,与,Hb,协同性的标志。,n=4(,理论的)，,n=1(,无相互作用),n=2.8(,实际观察到的),Hb,氧结合曲线的比较。,n=2.8,，,Hb,n=1.0,Mb,a,b,c,上述方程称为,Hill,方程,，用,log(,Y,/(1-,Y,),对,log,p,(,O,2,),作图得到,Hill,曲线。由于,O,2,与,Hb,的结合是协同的，所以,Hill,图实际上是,S,形的。,Hill,系数,n,H,是协同性程度的一种量度。,由,Hill,图得到,Hb,对第4个,O,2,的亲和力是第一个,O,2,的300倍。,当用,n,代替指数,4,得到：,对于,Hb,，在,50,饱和度时，,Y=1-Y,，从,Hill,方程最终可以得到下面的式子：,就是说：,Hb,和,Mb,的情况不同，对于,Hb,来说，其,P50,和,K,不相等；而对于,Mb,来说，两者是等值的。这是由于其结构上的差异和有无氧合协同效应所决定的。,血红蛋白的氧合,协同性使得它能够更有效地输送氧气。,协同效应，就是增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量。,血红蛋白氧合的协同效应使得它更有效地起着输送氧气的作用。如果没有协同效应，血红蛋白的氧合曲线将与肌红蛋白的相同，是,条双曲线。肺泡中的,PO2,为,100,torr,，工作肌肉的毛细血管中,PO2,约在,20,torr,血红红蛋白的,PO2,26,torr,n,=2.8,。,从图,可见,，在肺泡中,Y,是,0.97,，肌肉毛细血管中,Y,是,0.25,。释放的氧为两个,Y,值之差，,Y,0.72,。因此，,Y,是血红蛋白输氧效率的指标；协同效应将增加,Y,。,如果设想血红蛋白没有协同效应,(,如,n=1),，则其氧合曲线与肌红蛋白的一样，呈双曲线。从图的曲线可以看到，肌红蛋白输送氧从肺泡,(100,torr,),到肌肉,(20,torr,),虽然,PO2,有相当大的改变，但,Y,值坐化不大，,Y,不到0.1，因而到达肌肉后释放的,O2,很少。,4.2.4 H,+,、CO,2,和,BPG,对血红蛋白结合氧的影响,H,+,、CO,2,和,BPG,在血红蛋白上的结合部位虽然离血红素很远，但这些分子极大地影响,Hb,的氧合性质。这种在空间上相隔较远的部位之间的相互作用在很多寡聚蛋白质中存在，这就是,别构效应,。区别于,O,2,分子（同促效应），这些分子对与氧的结合的别构效应属于异促效应。,1.,H,+,、CO,2,促进血红蛋白对氧的释放,CO,2,水合的结果将增加组织中的,H,+,浓度，使得,pH,下降。氧与血红蛋白的结合受,pH,和,CO,2,浓度影响。,去氧血红蛋白对,H,+,的亲和力比氧合血红蛋白大。因此，增加,H,+,浓度将提高,O,2,从血红蛋白中的释放。,H,+,是血红蛋白氧合的拮抗剂。,pH,对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为,Bohr,效应(,Bohr effect),。,Bohr,效应具有重要的生理意义。,（1）在组织中，高的,H,+,浓度和较低的,pH,有利于血红蛋白释放氧气，有利于组织获得更多的氧气，而氧的释放又促使血红蛋白与,H,+,、CO,2,和结合，以补偿由于组织呼吸形成的,CO,2,所引起的,pH,降低，可以缓冲血液的,pH。,（2）,在肺部，由于氧压比较高，有利于血红蛋白与氧结合并因此促进了,H,+,、CO,2,和的释放，同时，,CO,2,和的呼出更加有利于氧气与血红蛋白的结合。,Hill,效应的生物化学机制：,H+,在血红蛋白中的结合部位是参与形成血红蛋白链间的盐桥。血红蛋白构象的变化，盐桥键的断裂和连接调节着,H+,与血红蛋白的结合并由此完成对,H+,的输送。,CO,2,在血红蛋白中的结合部位是4个亚基的,N-,末端的,-,氨基,。这些氨基在,T,态时都处于盐桥中，但,R,态时都以游离状态存在。,这些游离末端氨基以不解离的形式参与和二氧化碳的结合，生成,胺甲酸蛋白质,。,血红蛋白除从肺到组织，转运细胞所需的几乎所有的氧之外，还转运组织中形成的约20的总,H+、CO,2,到肺和肾，并在这里排出体外。,2.BPG,降低,Hb,对,O,2,的亲和力,BPG(2,3-,二磷酸甘油酸)是血红蛋白的一个重要的别构效应物。,正常人的红血球约含有4.5,mml,/L BPG，,约与血红蛋白等摩尔数，即维持,Hb:BPG,的化学计量。,Hb,分子只有一个,BPG,结合部位，位于由4个亚基缔合形成的中央孔穴中。,BPG,对于,R,态的亲和力至少比,T,态的,Hb,低一个数量级。,BPG,对于,R,态的,Hb,亲和力大小顺序是：,Hb,Hb(O,2,),2,Hb(O,2,),2,BPG,与,Hb(O,2,),2,则完全不结合。,BPG,和血红蛋白的结合有利于稳定血红蛋白的,T,态构象，促进氧的释放。,BPG,浓度的改变调节在某些生理型或病理性缺氧的有效组织供氧量。,氧的,S,型结合曲线,，,Bohr,效应,以及,BPG,效应物的调节,使得血红蛋白的输氧能力达到最高效率。同时，由于能够在较窄的氧分压范围内完成输氧功能，因此使机体内的氧水平不致于有很大的起伏。此外，血红蛋白使机体内的,pH,也维持在一个较稳定的水平。,4.3,血红蛋白的分子病,4.3.1 分子病是遗传的,与血红蛋白有关的疾病分为两类：,(1),血红蛋白病,(,hemoglobinopathy,),是由于,和,链发生了变化，如镰刀状细胞贫血病；(2),地中海贫血,(,thalassemia,)，,由于缺少了,和,链。如,-,和,-,地中海贫血病。,4.3.2 镰刀状贫血病,分子突变引起镰刀状细胞贫血病,是由于遗传突变导致血红蛋白中氨基酸残基被更换所致。,镰刀状细胞性贫血病的血红蛋白称为,Hb,S。,这是一种致死性疾病。它的杂合子患者由于能够抵御一种流行于非洲的疟疾(,malaria)，,使得隐性基因携带者上能够来得及繁衍下一代，这是因为杂合子患者加速被感染红细胞的破坏而中断疟原虫的生活周期的缘故。,镰刀状细胞贫血病患者的血红蛋白和红细胞的含量均为正常人的一半左右，而且红细胞的形态也不正常，除大量未成熟的红细胞之外，还有很多长而薄，呈新月状或镰刀状的红细胞。,镰刀状细胞贫血患者的红细胞变形是由于非正常的血红蛋白,S,引起的。,2,.,镰刀状细胞血红蛋白的,Aa,序列的细微变化,Pauling,L.and,Itano,H.,最早研究镰刀状细胞贫血病，通过指纹图谱和氨基酸序列分析发现二者的差异。,氨基酸组分分析表明，,Hb,S,和,HbA,的差别只是,Hb,A,的,链,N-,末端第6位的,Glu,被,Hb,S,的,Val,所替代,。整个蛋白质分子也只是两条,链总共两个氨基酸发生了变化。,正常的,Hb,A,和,Hb,S,的比较：,-,链完全相同，,链,发生了明显的变化。,Hb,S,的,链上,产生了一个“粘性”突起和疏水口袋,。,3.,镰刀状细胞的血红蛋白可以形成纤维状沉淀,由于,Glu,被,Val,取代，使得,HbS,分子表面产生了粘性凸起，与另一个,Hb,S,分子的互补口袋通过疏水作用而聚集发生沉淀。,纤维沉淀的形成压迫细胞使它弯曲呈镰刀状。,血红蛋白,Hb,S,严重的纤维化是导致患者死亡的更本原因。,4.,镰刀状细胞血红蛋白的治疗性矫正,Hb,S,分子的一个氨基用,KCNO,修饰后就能够抑制红细胞呈镰刀状。,4.3.3,其它血红蛋白病,血红蛋白突变导致血红蛋白下属4个关键区域之一的变化都可能造成严重的后果。,突变发生在分子的表面。,突变发生在血红素级的附近。如先天性青紫(,cogenital,cyanosis),的,HbM,Osaka(,2,58His-Tyr,2,)。,突变发生在特异的部位。,突变发生在亚基的界面上。,-,地中海贫血,-,珠蛋白的基因丢失或不能被表达。,-,地中海贫血,4.3.4 地中海贫血,有几条途径产生,:,(1)缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因；,(2)一个或多个基因发生了无义突变，结果产生缩短了的蛋白链，或发生移码突变，使合成的蛋白链含不正确的氨基酸序列；,(3)突变发生在编码区之外，导致转录被阻断或前体,mRNA,的不正确加工。,4.4,免疫球蛋白的结构和功能,免疫球蛋白又称为,抗体,(,antigen)，,是一类可溶性的血清糖蛋白，是血清中最丰富的蛋白质之一。,1.免疫球蛋白的结构,免疫球蛋白,G（Ig,G）,是血清中最基本的一类抗体，由4条多肽链组成，两条大的是,重链或,H,链,，两条小的为,轻链或,L,链,，它们通过非共价键和二硫键连接成一个蛋白复合体。,Ig,G,分子的两条重链在一端彼此作用，在另一端分别与氢链相互作用，,形成,Y,形结构,。,Ig,G,分子含有两个抗原结合部位，位于,Y,形结构的两个臂的顶端,。,轻链含有可变区(,V,区)和恒定区（,C,区）结构域；,重链也分为可变区和恒定区，标为,VH、CH1、CH2、CH3。,2.免疫球蛋白的类型,人的免疫球蛋白共有5种类型：,Ig,A、Ig,M、Ig,D、Ig,E,和,Ig,G。,Ig,分子氢链恒定区的氨基酸序列分为两种基本类型：,和,，,它们存在于所有的5类免疫球蛋白中。一种,Ig,分子或者是,或者是,。,重链恒定区（包括,C,H,1、C,H,2、C,H,3,）,的序列分别为：,、,和,。,每种免疫球蛋白只含有其中的一种类型，,Ig,G,、,Ig,A、Ig,M、Ig,D,和,Ig,E,分别含,、,、,和,。,免疫球蛋白的功能：,Ig,M,在对入侵抗原初次免疫反应的早期产生。只能存在于血流中。主要功能是抑制、凝集、溶解入侵血液的细菌。,Ig,A,主要存在于身体的分泌物，是初乳中的主要抗体。,Ig,D,存在与,B,淋巴细胞表面，功能不清楚。,Ig,G,时记忆细胞引发的再次免疫反应中的主要抗体，时血液中最丰富的免疫球蛋白，也是唯一能够通过胎盘进入体内的抗体。,Ig,E,在变态或过敏反应中起重要作用。,4.5,基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法,单克隆抗体和多克隆抗体。,ELISA,(enzyme-linked,immunosorbent,assay),酶联免疫吸附测定。一种测定抗原或抗体含量的方法。以待测抗原（或抗体）和酶标抗体（或抗原）的特异性反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）的含量。,ELISA,操作简便、易于重复、灵敏度高，广泛用于分子生物学和临床诊断的常规监测。,ELISA,操作步骤示意图,3.免疫印迹测定(,immunoblot,assay),又叫,Western,印迹(,Western blotting)：,类似于核酸分析的,Southern blotting。,