酶组化原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,根据标记物的不同，免疫细胞化学技术,可分为,:,免疫酶细胞化学技术,;,免疫荧光细胞化学技术,;,免疫铁蛋白技术,;,免疫金,银细胞化学技术。,各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，,都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。,免疫酶组织化学技术,基 本 原 理,抗原,抗体,（特异性）,酶标记抗体,，通过酶与,底物,作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。,免疫酶组化,免疫学,(,抗原抗体反应,),酶细胞化学,(,底物显色反应,),+,特异性 敏感性 定位性 可视性,免疫酶组织化学基本组成：,抗原,抗体,放大系统,显色系统,PAP,法,-,非标记抗体法,过氧化物酶,抗过氧化物,酶抗体,ABC,法,-,酶标记抗体法,生物素,卵白素,strept,avidin,-biotin,complex,SABC,AB,是一般抗原,抗体亲和力,的一百万倍,链霉亲和素的免疫组化方法背景,二抗募集一百个左右的,过氧化物酶,和,五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物,免疫酶特点：,信号定位准确,标本可长期保存,阳性标记与病变关系,方法简便，易推广,第一节,酶 和 底 物,一、酶及其特点,酶选择标准：,该酶用细胞化学易于被检出，,能被光镜或电镜观察。,酶反应产物须稳定，不扩散，,具有良好定位。,酶易于纯化，获得纯制品。,酶与免疫球蛋白结合后，不丧,失其活性。,酶在,PH,中性液内较稳定。,组织中不应存在与底物作用,的内源性酶。,符合上述条件：,辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,葡萄糖氧化酶,（一）辣根过氧化物酶,（,HRP,）,分子量（,40KDa,），不会遮盖抗,原的结合部位,稳定，易获得较高纯度酶,具有较高活性及特异性,可溶性佳，生成的产物不扩散,组织中内源性酶较少,HRP,穿透力强，易进入细胞内,发挥作用，可显示多种颜色,DAB-,棕黄色,（稳定，不溶于有机溶剂）,ACE-,红 色,（不稳定，溶于有机溶剂）,（二）碱性磷酸酶,（,AKP,）,从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取,组织穿透能力较弱,内源性,AKP,较高,左旋咪唑具有抑制作用,可作用于多种底物,快蓝,-,蓝色 快红,-,红 色,（溶于有机溶剂，不能进行脱水透明）,应用面较窄：内源性过氧化物酶含量高的血细胞、,淋巴细胞染色,（三）葡萄糖氧化酶（,GOD,）,底物为葡萄糖，终产物稳定,体内无内源性,GOD,分子量大，穿透力较弱,二、底物及其特点,酶底物酶,底物酶产物（显色）,HRP,的底物：,HRP,的底物为低浓度的,H,2,O,2,，,供氢体为胺类及酚类化合物。,HRP,显色反应：,HRP,H,2,O,2,HRP,H,2,O,电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,HRP,常用的电子供体：,3.3-,二氨基联苯胺,(DAB),棕色,氨乙基卡巴唑,(AEC),红色,，易,溶于有机溶剂，易扩散，用水,溶性封固剂。,4-,氯,-1-,茶酚（,4CN,）,蓝色，,易弥散，不能久保存,3.3,，,5.5-,四甲基联苯胺,(TMB),黄色,AKP,底物：,AKP,常用的底物为,-,萘酚,AS-B1,磷酸盐,偶联试剂：固兰蓝色,固红红色,第二节,酶标记抗体法,酶标记抗体法（,Enzayme,Labelled,antibody,）,是将酶通过,共价键结合,在抗体分子上，制备成,酶标记抗体,，通过抗体去寻找相应抗原。,一、直接法,原理：,HRP,标记在特异性抗体,（第一抗体）上，抗原,-,抗体,HRP,复合物,组织抗原,第一抗体,过氧化物酶,直接法,步骤：,一步完成,特点：,方法简便、省时，专一,性强，非特异染色轻，,但敏感性差，一种标记,抗体只能检测一种抗原。,二、间接法,原理：,HRP,标记在第二抗体上，,抗原,-,特异性抗体,-,第,二抗体,HRP,复合物,步骤：,二步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,特点：,敏感性较直接法高，一,种标记抗体能用于相应,动物制备的多种特异性,抗体，检测多种抗原。,但较直接法费时，非特,异染色稍重。,第三节,酶 抗 酶 法,非标记抗体法,制备抗酶抗体,制备,PAP,复合物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,一、,PAP,法,原理：,抗原,-,特异性抗体,-,第,二抗体（桥抗体）,-,PAP,复合物,步骤：,三步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP,复合物,PAP,法,HRP,特点：,敏感性较高，背景染色较轻,二、双,PAP,法：,原理,：,在,PAP,的基础上再重复,第二抗体和,PAP,复合物,抗原,-,特异性抗体,-,第二抗体（桥抗体）,-PAP-,第二抗体,-PAP,复合物,双,PAP,法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP,复合物,HRP,步骤：,五步法,特点：,敏感性较高,缺点：,但步骤多，费时，非特,异背景重,三、,APAAP,法,原理：,抗原,-,特异抗体,-,第二,抗体,-APAAP,复合物,步骤：,三步法,APAAP,法,特点：,非特异背景较轻，不受内,源性酶的干扰。,但产物易溶于有机溶剂,第四节,卵白素,-,生物素法,Avidin,(,卵白素,),为一种碱性糖蛋白，由四个相同的亚基组成,Biotin,（生物素）,小分子维生素,Avidin,和,Biotin,具有较高亲和力,一、,ABC,法*,Avidin,Biotin Complex,原理：,酶标记,Biotin,形成酶素化,Biotin,酶素化,Biotin,Avidin,-ABC,复合物,抗原,-,特异抗体,-Biotin,标记,第二抗,-,Avidin,Biotin,HRP,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,卵白素,ABC,法,步骤：,三步法,特点：,敏感性较高，特异性强，,应用范围广,某些脏器存在内源性生物素,干扰,Avidin,与核酸及细胞膜中磷脂,有非特异反应,SABC,法,Streptavidin,biotin,Peroxidase,Complex,SABC,法已代替,ABC,法,二、,LSAB,法,Labelled,Streptavidin,Biotin Method,原理：,Biotin,标记第二抗体,LSAB,法,HRP,标记,Avidin,抗原,-,特异性抗体,-Biotin,标记第二抗体,-,Avidin,HRP,复合物,步骤：,三步法,特点：,敏感性高，特异性强，,方法简便,第六节,多聚合物酶法,多,聚合物酶法,HRP-,多聚合物,-,抗体,一、,Epos,法,Enhanced polymer one-step staining,组织抗原,一抗,HRP,多聚,骨架,EPOS,方法,原理：,采用一种具有惰性的多聚,化合物作为骨架，将特异,性抗体和,HRP,，,同时标记,在多聚合物分子上，形成,HRP-,多聚合物,-,特异性,抗体。,步骤：,一步法,特点：,快速，简便，特异性强，,敏感性高,但商品化种类不全，,价格昂贵,二、,EnVision,法,Enhanced,Labelled,Polymer System,原理：,HRP-,多聚合物,-,第二,抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚,骨架,第一步,第二步,EnVision,TM,方法,特点：,敏感性高：,（,1 mole,复合物中含,70mole HRP,和,10 mole,第二抗体）,特异性强：,复合物内无内源性,Avidin,和,Biotin,的干扰。,第六节,基本操作步骤,抗原修复,内源性过氧化物抑制,正常血清封闭,第一抗体,第二抗体,酶标记体,DAB-H,2,O,2,显色,第八节,抗原定位及非特异染色,组织细胞,固定问题,脱蜡不彻底,内源性过氧化物,内源性生物素,抗原,抗原弥散,抗原异常表达,共同抗原决定簇,特异性抗体,非特异吸附,抗体不纯,交叉反应,第二抗体,IgG,交叉反应,二抗不纯,标记物,质量,纯度,标记水平,底物溶液,DAB,H,2,O,2,操作,复染,抗体稀释度,孵育时间,PAS,洗涤,