chap6 GPI蛋白.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二层,第三层,第四层,第五层,*,第五章 糖基磷脂酰肌醇化蛋白及有关糖复合物,蛋白质锚定在膜表面的新方式,还记得脂筏吗？,膜蛋白的引渡船,脂筏的组成成分,脂筏（,lipid raft,）是质膜上富含,鞘糖脂、,GPI,蛋白和胆固醇,的微结构域（,microdomain,）。,蛋白质与膜表面的结合方式,1,2,：整合蛋白,3,4,：锚定蛋白,5,6,：外周蛋白,糖基磷脂酰肌醇化蛋白,一类由蛋白质、脂质和糖链三者共价结合的复杂的糖复合物,糖基磷脂酰肌醇,(,glycosylphosphatidylinositol,GPI),化蛋白。,GPI,蛋白的分布,1985,年以锥虫表面抗原为例阐明其结构,GPI,蛋白广泛存在于真核生物，包括原生动物、酵母、粘菌、无脊椎动物等以及哺乳动物的血液、肝、肾、胎盘和脑等组织。,目前已发现近百种,GPI,蛋白，包括多种水解酶、细胞粘附分子、哺乳动物细胞表面抗原和受体、原虫抗原、补体调节蛋白、朊病毒等。,GPI,化蛋白的种类和分布举例,补体调节蛋白类,粘附分子类,酶类,许多细胞和非造血细胞,反应性溶血膜抑制物,(CD59),许多细胞和非造血细胞,衰变加速因子（,CD55,DAF),神经细胞、胶质细胞,神经粘附因子,许多造血细胞,CD58(LFA-3),哺乳动物组织,5-,核苷酸酶,人及羊红细胞、电鳗电器管,乙酰胆碱酯酶,胎盘、肠等哺乳动物组织,碱性磷酸酶,GPI,化蛋白的基本结构,蛋白质,：,C,末端残基与,GPI,锚相连，通常为,Gly,、,Ala,、,Ser,、,Cys,、,Asp,、,Asn,。,有些本身是糖蛋白。,磷酸乙醇胺桥,糖链,:,接在肌醇磷酸的,6,位,共有的四糖结构：,Man-Man-Man-,GlcN,肌醇磷酸,插入脂双层内的,长脂肪链,：,脂酰甘油或甘油醚；极个别被神经酰胺取代。,GPI,锚,GPI,化蛋白的结构要点,结构组成,脂肪链与甘油的连接方式,糖链的修饰变化,糖链与肽链的连接,极个别脂酰甘油被,Ceramide,代替,其它,GPI,有关糖复合物,存在于一些寄生性原虫表面：,脂肽磷酸聚糖,(LPPG),糖肌醇磷酸聚糖,(GIPL),脂磷酸聚糖,(LPG),糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖,(,glypican,),三种致命的原虫,布氏锥虫（,Trypanosoma,brucei,）,引起的非洲昏睡病在撒哈拉以南的非洲地区每年感染万人，如果得不到及时治疗，往往会“杀人于昏睡之中”。,枯氏锥虫（,Trypanosoma,cruzi,）,引起南美锥虫病，它由锥蝽叮咬人后排泄的粪便传播，在拉美地区每年导致万人死亡。,硕大利什曼原虫（,Leishmania,major,）,引起的黑热病蔓延大洲、多个国家，是公共卫生的严重威胁。,锥虫,(,Trypanosomes,),和昏睡症,(,Sleeping Sickness,),非洲昏睡病,锥虫寄生之谜,锥虫本身对抗体和补体高度敏感,它们却生活在布满免疫细胞的血液系统,它们可引发强烈的免疫反应,然而他们可以在同一宿主体内繁殖生活一年或更长，直至宿主死亡,the GPI anchor,GPI,锚的加工是在翻译后立即添加的,蛋白质的,C,端疏水区作为信号肽，可被切除然后以转肽反应被糖脂取代，形成,GPI,化蛋白,锥虫表面的抗原变化,GPI,锚可在锥虫表面形成高度密集的排列,锥虫表面于是形成由可变表面糖蛋白（,Variant Surface,Glycoproteins,VSGs,）组成的致密外壳,这种外壳与利氏曼原虫表面的脂磷（酸）聚糖 相当,锥虫的基因组与,VSG,锥虫为单细胞真核生物，其染色体为二倍体。布氏锥虫含有,100,个小染色体和,20,个较大染色体，编码,VSG,的基因在各种染色体上都有。,锥虫基因组中的,6-10%,编码,VSGs,(more than 1000 genes),根据在染色体上的位置分为内部,VSG,基因和端粒,VSG,基因，,VSG,基因的表达总是在端粒的表达位点,（,Expression site,ES,）,上进行。表达位点有多个，但一定时期只激活一个。,在特定时期只有一种,VSG,基因表达，而其他,999,种都被关闭,VSG,基因表达的转换以很低几率发生，如果宿主产生了对前一种,VSG,的抗体，则新的表达型就会迅速扩增起来,What is the advantage of expressing a single VSG?,How is expression controlled?,What mechanisms can you think of by which a cell could control gene expression and protein abundance?,Antigenic variation,所有的,VSGs,都是,65,kDa,的,GPI,蛋白，在细胞表面呈二聚体,蛋白的外端高度可变，但,Cys,的位置保守,其他非可变蛋白如转铁蛋白受体或己糖转运体隐藏在表面外壳内部,Antigenic variation,锥虫基因组中有,1000,个基因编码表面抗原,但每个特定时期只有一个,VSG,基因被表达,启动子调节？,基因的位置？,其他机制？,转座效应,Transposition of VSG genes occurs by intra-or intermolecular recombination,This explains switching but not really why one gene is active and all the others are silent,碱基的稀有修饰,染色质修饰调控基因表达,实际上发现失活和激活部位的一种特殊修饰（标记为,J(,b,-glucosyl-hydroxy-methyluracil,),有差异,But is this a chicken or an egg?,GPI,抗原的“漂移”？,在非洲锥虫病病人的红细胞膜上发现了锥虫的一种,GPI,蛋白表面抗原！,GPI,锚介导蛋白质在细胞表面转移,细胞表面工程,许多细菌、寄生虫毒性蛋白也是,GPI,蛋白，可把毒素转移给宿主细胞。如何抑制？,GPI,化蛋白的生物合成,核糖体合成新生肽链,内质网腔,N-,端去除,1530aa,信号肽,C-,端去除,1530,个,aa,肌醇磷酸,GPI,锚,GPI,化蛋白,细胞质,逐个添加糖基,磷酸乙醇胺,运往质膜表面,Biosynthetic pathway of GPI-anchor,Proteolytic,cleavage at,w,site,Addition of preformed GPI anchor at C-terminus through an amide linkage,to the ethanolamine of the GPI anchor,Protein can be released by action of cell surface,phospholipase,GPI=,glycosylphosphatidylinositol,:lipid modification that anchors,proteins to the cell surface,GPI,化标记,GPI,化蛋白运送到质膜表面的方式,小窝蛋白,GPI,化蛋白的降解,磷脂酰肌醇,4,5,二磷酸,(PIP2),PLC,IP3,DAG,PKC,Ca,2+,GPI,蛋白,PLC,DAG,GPI,化蛋白的生物功能,免疫及神经细胞活化：,T,细胞活化,神经细胞表面的,N-CAM,和,CNTF,受体,与,信号转导,：脂筏,作为受体,叶酸受体,墨素转铁蛋白,(,melanotransferrin,),GPI,蛋白锚定的优势,可能赋予膜蛋白的较大的横向运动性,通过激活脂酶介导蛋白质的释放和分泌,靶向膜蛋白使其定位于细胞表面特定的区域,通过内吞作用调节细胞表面蛋白质的周转,参与受体介导的传递跨膜信号,GPI,锚定蛋白的鉴定,水解细胞膜表面蛋白的,GPI,锚,细菌中提取的,PI-PLC,锥虫中的,GPI-PLC,血清中,GPI-PLD,氢氟酸,稀亚硝酸,Western blot,鉴定,GPI,裂解位点,Enzymatic and chemical cleavage sites of GPI anchors useful in identifying GPI-anchored membrane proteins.,(GPI-PLC)GPI-specific,phospholipase,C;,(GPI-PLD)GPI-specific,phospholipase,D;,(HF)hydrogen fluoride;(HONO)nitrous acid;,(,NaOH,NH3)mild alkali treatment with either sodium hydroxide or ammonia;,(PI-PLC),phosphatidylinositol,-specific,phospholipase,C.,GPI,化蛋白与疾病和药物设计,阵发性夜间血红蛋白尿症,(PNH),GPI,化蛋白与细胞表面工程,GPI,化蛋白与抗感染药物设计,通过抑制,GPI,锚结合蛋白从膜上释放而抑制病原毒素向宿主的转移,GPI,蛋白与细胞表面工程,体外,GPI,化蛋白可从一个细胞转移到另一个细胞表面,细胞表面工程的步骤：,把目的蛋白,cDNA,与,GPI,结合必需的,C-,端肽,cDNA,融合表达，即可形成新的,GPI,化蛋白。,提取蛋白质与靶细胞保温，,GPI,蛋白即可自动组装到靶细胞上。,细胞表面工程的优点,制备较大量的,GPI,化蛋白,可在一些难以基因转染的细胞表面表达目的蛋白,可对细胞表面蛋白进行修饰,多种,GPI,蛋白可以同时结合在一个细胞表面,阵发性夜间血红蛋白尿症,(PNH),Paroxysmal nocturnal,hemoglobinuria,(PNH),：,成人发病率,1/10,5,10,6,。,是一种获得性溶血性贫血，其病因是细胞膜上缺失十几种,GPI,化蛋白，如作为补体调节蛋白的衰变加速因子,(DAF),和补体,C,8,的结合蛋白等，使红细胞对补体敏感性增加而产生红细胞溶血。,缺陷在于,GPI,生物合成的第一步，即,GlcNAc,向磷酸肌醇转移这一步，相关的基因是磷脂酰肌醇聚糖,A(phosphatidylinositolglycan,class A,PIG-A),基因。,Haemoglobinuria,:Urine passed 7am is dark containing a large amount of free,haemoglobin,which leaks out of PNH red-cells as they burst.The urine generally clears during the day.,PNH,患者的血尿症状,PNH,机制,PNH,的治疗,骨髓移植,补体抑制剂：,Alexion,制药公司,(Cheshire,CN,USA),获得了美国食品药品管理局,(FDA),批准使用,Soliris,(,eculizumab,),治疗,PNH,患者以降低溶血。,扩增正常细胞：生长因子？,25%of PNH patients survive 25 years-one half of these go on to spontaneous remission,将正常人红细胞释放的囊泡与,PNH,患者红细胞共置，回流。,造血干细胞基因治疗,思考题,GPI,蛋白的结构组成？,GPI,蛋白的生物合成过程？,GPI,蛋白在细胞表面的锚定方式与糖蛋白相比有什么优势？,GPI,蛋白的分布和主要生物功能,GPI,蛋白在生物工程中的应用,