中药药理实验方法学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药理实验实验方法学,第二讲 中药药理研究的基本知识（,2,）,第三节 实验设计,主要内容,五、实验数据的整理,一、基本原则,二、实验对象,三、效应指标,四、剂量设计,一 基本原则,对照原则,随机原则,重复原则,（一）、对照原则,常用的对照形式：,（,1,）组间对照,（,2,）自身对照,（,3,）配对对照,（,1,）组间对照,正常对照组（空白对照、阴性对照、溶媒对照）；假手术对照组,模型对照组,阳性对照组,阳性对照,意义：,检验实验体系是否可靠,粗略估计受试药与对照药相比，作用强度与特点上有哪些差异。,（,2,）自身对照,观察同一个体给药前、后的区别。被检药物和阳性药在同一个体上的作用比较。,（,3,）配对对照,差异最小的两个个体配成一对，一个给予受试药，一个给予对照药。,（二）、,随机原则,目的：,（,1,）避免非研究因素影响。,（,2,）除研究因素外，提高各比较组的其他因素的均衡性、可比性。,随机分组的方法：,（,1,）抽签随机法：,例：,30,只小鼠，要求随机分为,3,组：,可先将,30,只小鼠按,1,至,30,编号，做,1-30,号签，充分混合号签后，随机各取,10,枚为一组。,（,2,）随机数字表法（或随机排列表法）：,15,只小鼠，要求随机分为,3,组,.,在随机数字表中确定某个数字开始，随机选取数字方向，得到一组随机数字，除以组数，得到余数，根据余数编组,：,顺序号,:,A,组：,1,，,9,，,12,，,13,，,15,B,组,:2,，,3,，,5,，,7,，,10,，,11,C,组：,4,，,6,，,8,，,14,按原随机数字顺序继续抄一随机号,:08,除以,6,余数,:2,将,B,组第二只，即,3,号小鼠编入,C,组。,调整后各组的编号,:,A,组：,1,，,9,，,12,，,13,，,15,B,组：,2,，,5,，,7,，,10,，,11,C,组,:3,，,4,，,6,，,8,，,14,练习：,20,个小鼠，根据下例随机数顺序，将其随机分成,4,组。,取随机数字表中,随机号：,22 17 68 65 81 68 95 23 92 35,87 02 22 57 51 61 09 43 95 06,58 24 82 03 47,鼠号：,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,随机号：,22 17 68 65 81 68 95 23 92 35,除以,4,余数：,2 1 0 1 1 0 3 3 0 3,鼠号：,11 12 13 14 15 16 17 18 19 20,随机号：,87 02 22 57 51 61 09 43 95 06,除以,4,余数：,3 2 2 1 3 1 1 3 3 2,随机号（备用）：,58 24 82 03 47,根据余数分组鼠号：,A,组,（余数,1,）：,2 4 5 14 16 17,B,组,（余数,2,）：,1 12 13 20,C,组（余数,3,）：,7 8 10 11 15 18 19,D,组（余数,0,）：,3 6 9,随机号（备用）：,58 24 82 03 47,58/6,余数为,4,，即,A,组第,4,个动物（,14,号）编入,B,组。,根据余数分组鼠号：,A,组：,2 4 5 16 17,B,组：,1 12 13 20 14,C,组,：,7 8 10 11 15 18 19,D,组,：,3 6 9,随机号（备用）：,58,24 82 03 47,24/7,余数为,3,，即,C,组第,3,个动物（,10,号）编入,D,组。,根据余数分组鼠号：,A,组：,2 4 5 16 17,B,组：,1 12 13 20 14,C,组,：,7 8 11 15 18 19,D,组,：,3 6 9 10,随机号（备用）：,58 24,82 03 47,82/6,余数为,4,，即,C,组第,4,个动物（,15,号）编入,D,组。,调整后随机分组的结果为（按动物号）：,A,组：,2 4 5 16 17,B,组：,1 12 13 20 14,C,组：,7 8 11 18 19,D,组：,3 6 9 10 15,学生练习题一,30,个小鼠，根据下例随机数顺序，将其随机分成,5,组。,取,随机数字：,37 56 08 18 09 77 53 84 46 47,31 91 18 95 58 24 16 74 11 53,10 13 85 57 61 65 61 68 66,27 47 39 19 84 83 70 07 48,（,3,）分层随机,先将需严格控制的主要因素，如性别、体重等分为不同类别，或层次；在每一类别或层次中分别随机分成一定组。,将每一类别或层次随机分成的组,组次相同的分别合并。,（三）、,重复原则,目的：,验证在类似的条件是否可获得结果的重现以及结果的变异情况,。,要点：,A.,确定适当的样本数。,B.,各组动物数目尽量相同。,按动物类型确定样本数：,（,1,）小动物：计量,10,例,;,计数,20-,30,例,（,2,）中等动物：计量,8,例,;,计数,20,例,（,3,）大动物：,5-6,例,二、实验对象,(,一,),、受试动物,1,、按要求选择不同级别符合医学实验标准的动物,一级：普通动物（亦称常规动物或无疾病的动物）；,二级：清洁动物（饲养在温度恒定，普通设施中的动物，饲料、垫料，用具均经过高压消毒）；,三级：无特殊病原体动物（,specific-pathogen free,简称,SPF,动物）；在清洁级基础上还需不带干扰实验的微生物，在隔离室或层流室饲养。,四级：无菌动物（机体内外均无任何寄生虫的动物，一般是临产前按无菌手术 剖腹取出胎仔，在无菌条件下用无菌饲料繁养获得的动物）。,2,、根据实验目的选择敏感种系,（不同种属动物对药物敏感性、药物代谢动力学不同）,原则,:,选择对药物的反应与人体相近的种系。,热源实验：,家兔，对热敏感性高。,测定胆汁流量：,大鼠，无胆囊，可以胆管插管。,心血管系统,:,大鼠、猫、犬等。,呕吐实验：,鸽、猫或狗等。,抗肿瘤实验：,裸鼠，免疫功能缺陷。,过敏试验：,豚鼠敏感。,组织胺：,可引起豚鼠哮喘的发生，但对家兔引起的是血管的收缩和右心室功能的衰竭。,苯：,家兔：白细胞减少及造血器官发育不全；犬：白细胞增多，脾脏和淋巴结增生。,3,、性别：根据要求选择,用一种性别比两种性别兼用所得结果离散度较小。通常优选雄性或雌雄各半。,4,、年龄体重,每批动物的体重，年龄越接近越好,通常：,小鼠,:18-22g,，大鼠,:200,25g,，,豚鼠,:250-300g,，兔、猫,:1.5-2Kg,犬,:10-15kg,。,大鼠、小鼠,:6-8,周龄,5,、数量,计量研究：小鼠每组,10,只,大鼠每组,8,只,豚鼠或兔每组,6,只,猪或犬,5,只,计数研究：大、小鼠每组,20-30,只,6,、习性,:,小鼠、大鼠均为群居动物，不宜单独饲养。,7,实验条件控制,时辰：,动物生理活动有其昼夜节律，如小鼠夜间活动增加，白天活动减少。最好每批实验在每天相同的时间测定。,环境温度：,室温稳定、适宜。,饮食：,有些实验需对动物禁食。,适应：,3,7,天。,（二）受试药,1.,制备情况,（,1,）新药受试药要求：用处方固定，质量稳定、工艺、质控指标恒定后的中试产品。,（,2,）一般受试中药：生药经鉴定，科属种清楚；提取制备工艺明确，含量确定。,（,3,）单体：化学结构式清楚。,（,4,）在注射给药或离体试验时应注意药物中杂质、不溶物质、无机离子及酸碱度等因素对实验的干扰。,2,、,给药途径,实验的给药途径与临床拟使用的途径一致。,中药粗制剂一般不用注射给药或体外实验的方法检测药物效应。,3,、,给药时间及次数,最好每日固定同一个时间给药。,急性实验通常也需连续给药,3-5,天以上。,预防性给药,：,治疗给药,：,4,对照药,合法性：,中国药典,收载或符合部颁标准，或新批准合法生产的药物。,可比性：其功用、主治、剂型（给药途径）与受试药相似。特殊情况下，在合理范围内可适当灵活掌握。,择优选用：有多种同类药可供选用时，应择优选用公认疗效较好的药物。,三、效应指标,观测指标应选用特异性强、敏感性高、重现性好，客观、定量或半定量的指标进行观测。,四、剂量设计,剂量的表示方法：,g/kg,mg/kg,ml/kg,（中药）,g,生药,/kg,例如：,1,、取,50g,远志，水提浓缩后为,50ml,。灌胃给予小鼠，给药容量为,0.2ml/10g,体重，计算远志的给药剂量。,2,、,100%,大黄水煎液，灌胃给予大鼠，给药容量,1ml/100g,体重，计算大黄的给药剂量。,剂量组数：,新药研究至少设,3,个剂量组。,三者最好成等比，能反应量效关系。,给药容量相等，浓度不等。,合理选择剂量：,（,1,）参考,LD,50,：在,LD,50,的,1/10,、,1/20,、,1/40,等范围内设置高、中、低剂量组。,（,2,）根据临床用药等效量计算,不同种类动物等效用药量的计算,p191,小白鼠,20g,大白鼠,200g,豚鼠,400g,兔,1.5kg,猫,2.0kg,猴,4.0kg,狗,12.0kg,人,70.0kg,小白鼠,20g,1.0,7.0,12.25,27.8,29.7,64.1,124.2,387.9,大白鼠,200g,0.14,1.0,1.74,3.9,4.2,9.2,17.8,56.0,豚鼠,400g,0.08,0.57,1.0,2.25,2.4,5.2,10.2,31.5,兔,1.5kg,0.04,0.25,0.44,1.0,1.08,2.4,4.5,14.2,猫,2.0kg,0.03,0.23,0.41,0.92,1.0,2.2,4.1,13.0,猴,4.0kg,0.016,0.11,0.19,0.42,0.45,1.0,1.9,6.1,狗,12.0kg,0.008,0.06,0.10,0.22,0.23,0.52,1.0,3.1,人,70.0kg,0.0025,0.018,0.031,0.07,0.078,0.16,0.32,1.0,应用举例：,某复方的总药量是,70g/,剂，每天,1,剂。按实验动物与人用药量折算表计算，,200g,重大鼠等效量是多少？,答：,200g,重大鼠等效量为：,70g,0.018=1.26g/,只,小白鼠,20g,大白鼠,200g,豚鼠,400g,兔,1.5kg,猫,2.0kg,猴,4.0kg,狗,12.0kg,人,70.0kg,小白鼠,20g,1.0,7.0,12.25,27.8,29.7,64.1,124.2,387.9,大白鼠,200g,0.14,1.0,1.74,3.9,4.2,9.2,17.8,56.0,豚鼠,400g,0.08,0.57,1.0,2.25,2.4,5.2,10.2,31.5,兔,1.5kg,0.04,0.25,0.44,1.0,1.08,2.4,4.5,14.2,猫,2.0kg,0.03,0.23,0.41,0.92,1.0,2.2,4.1,13.0,猴,4.0kg,0.016,0.11,0.19,0.42,0.45,1.0,1.9,6.1,狗,12.0kg,0.008,0.06,0.10,0.22,0.23,0.52,1.0,3.1,人,70.0kg,0.0025,0.018,0.031,0.07,0.078,0.16,0.32,1.0,人的每公斤体重给药量为：,70g,70=1g/kg,。,大鼠每公斤的给药量是：,1.26g,1000/200=6.3g/kg,按体重计算，要达到等效，大鼠的剂量应为人用剂量的,6.3 g/kg,1 g/kg=6.3,（倍）。,不同种类动物等效用药量的计算,小白鼠,20g,大白鼠,200g,豚鼠,400g,兔,1.5kg,猫,2.0kg,猴,4.0kg,狗,12.0kg,人,70.0kg,小白鼠,20g,1.0,7.0,12.25,27.8,29.7,64.1,124.2,387.9,大白鼠,200g,0.14,1.0,1.74,3.9,4.2,9.2,17.8,56.0,豚鼠,400g,0.08,0.57,1.0,2.25,2.4,5.2,10.2,31.5,兔,1.5kg,0.04,0.25,0.44,1.0,1.08,2.4,4.5,14.2,猫,2.0kg,0.03,0.23,0.41,0.92,1.0,2.2,4.1,13.0,猴,4.0kg,0.016,0.11,0.19,0.42,0.45,1.0,1.9,6.1,狗,12.0kg,0.008,0.06,0.10,0.22,0.23,0.52,1.0,3.1,人,70.0kg,0.0025,0.018,0.031,0.07,0.078,0.16,0.32,1.0,如同一复方要用小鼠实验，小鼠每只的给药量为：,70,0.0025,0.175g/,只；,0.175,20/1000=8.75 g/kg,；,按体重计算，要达到等效，小鼠的剂量应为人用剂量的,8.75 g/kg,1 g/kg=8.75,（倍）。,豚鼠应用量为,70,0.031=2.17g/,只；,2.17,400/1000=5.425 g/kg,。,按体重计算，要达到等效，豚鼠的剂量为人用量的,5.425,1,5.425,（倍）。,兔：,70,0.07,4.9g/,只；,4.9,1.5,3.27 g/kg,。,按体重计算，要达到等效，,兔的剂量应为人用量的,3.27,1,3.27,（倍）。,狗用量为,70g,0.32,22.4g/,只；,22.4,12=1.87g/kg,。,按体重计算，要达到等效，,狗的给药量应为人的,1.87,1,1.87,（倍）,不同种类动物间用药剂量换算表（转换因子 计算法）,某利尿中药,250g,重大鼠的有效量为,250 mg/kg,，,试计算,15kg,犬的等效实验剂量？,犬的等效实验剂量,250 mg/kg,6.9,22,=78.4mg/kg,（,3,）根据文献估计剂量,如有相关的药物，相似的复方，其使用剂量可作为参考。,（,4,）通过预试估计剂量,5,给药容量：,小鼠口服和腹腔注射：,0.1-0.3 ml/10g,，皮下和静脉注射通常,0.1-0.2 ml/10g,，肌肉注射每条腿不宜超过,0.1ml,。,大鼠口服：,1.0-1.5 ml/100g,腹腔注射通常,0.5-1 ml/100g,皮下和静脉注射一般为,0.3-0.5 ml/100g,。,药物溶液配置,例：戊巴比妥钠对小鼠腹腔注射的有效麻醉剂量为,40mg/kg,。,现有体重为,20g,左右的,30,只小鼠要麻醉。试问要称量多少克的戊巴比妥钠，设计的给药容量为多少，配成怎样浓度？,药物溶液配置,答：称量戊巴比妥钠,30mg,，,加生理盐水至,7.5ml,使浓度为,4mg/ml,小鼠腹腔注射,0.1ml/10g(,即,10ml/kg),。,或：称量戊巴比妥钠,40mg,，,加生理盐水至,10ml,使浓度为,4mg/ml,小鼠腹腔注射,0.1ml/10g(,即,10ml/kg),。,五、实验数据的整理,（一）原始数据记录、整理,（二）统计分析,（三）讨论分析,（一）原始数据记录、处理,P192,1,、原始记录,基本要求：,真实，及时，直接，清楚，准确，完整、防止,随意,涂改、不易消除等。,主要内容：,实验名称、研究目的、研究机构名称、实验材料、实验环境、方法、实验过程、结果及分析、实验人员、日期等。,注意事项：,2,、数据表达和精确度：,一般应至少有,3,位有效数字，,标准差至少有,2,位有效数字，,均数的小数位数应与标准差相同，,出示的结果应包括均数，标准差，例数，,P,值情况（大于、小于,0.05,或具体,P,值）,数字的精确度要与测量仪器所能达到的精确度一致。,3,、极端数据的处理,：,尽量避免差错形成极端数据。,（,1,）对可疑数据,及时复测或复核,及时纠正差错。,（,2,）对于无法复测，但是可以肯定是处于差错，,可以删除。,（,3,）在一组属于正态分布的数据中，超出（均数,3,倍标准偏差）,之外的数据，可考虑舍弃。,一组数据按正态分布时：,x,s,内的数据占,68.27%,x,1.96s,内的数据占,95.0%,x,2.58s,内的数据占,99.0%,（二）数据统计分析,（,1,）两组间实验结果比较常用,t,检验 （,unpaired t test,）。,（,2,）多组间比较：方差分析（正态分布）,（,3,）非正态分布：秩和检验，序值法,（,4,）样本率比较：,X,2,检验,T,值计算公式（通式）,EXCEL,软件,T,检验过程：,选中,fx,T TEST,显示填写框：,Array 1,A1:A9,Array 2,B1:B9,Tails,2,Type,Array 1,为第一个数据集。,Array 2,为第二个数据集。,Tails,指示分布曲线的尾数。,如果,tails=1,，,函数,TTEST,使用单尾分布。如果,tails=2,，,函数,TTEST,使用双尾分布。,Type,为,t,检验的类型。,1,：成对检验,2,：等方差双样本检验,3,：异方差双样本检验,（三）,实验结果,讨论分析,除了分析起是否有统计学意义，还应从专业知识的角度分析是否有生物学意义。,