DNA酶切及凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,DAN,酶切及凝胶电泳,.,DNA,限制性内切酶的酶切分析,限制性核酸内切酶：,是一类能识别双链,DNA,分子特定的核甘酸序列,，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,进行切割的一类,DNA,水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。,限制性核算内切酶的相关知识：,寄主控制的限制与修饰现象,核酸限制性内切酶的类型及基本特性,同裂酶和同尾酶,影响核酸限制性内切酶活性的因素,.,1.,寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。,限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力。限制酶,限制外源,DNA,存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的,DNA,不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的,DNA,进行了修饰，限制性酶对修饰过的,DNA,不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,.,2.,核酸限制性内切酶的类型及基本特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：,型、,型、,型。,型,：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,DNA,分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类酶如：,E,coB,、,E,coK,等。,.,型,：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。,这类限制酶识别的专一核苷酸顺序常见的是,4,至,6,个核苷酸，其识别顺序是一个,回文对称顺序,，即有一个中心对称轴。,.,型酶的切割有两种方式，分别生成平头末端、粘性末端。,平头末端,：在同一位置上切割双链，产生平头末端，这种末端可以通过,DNA,连接酶连接起来。例如,EcoRV,的识别位置是：,5GAT,ATC3,3CTA,TAG5,粘性末端,：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，其断裂的磷酸二酯键和氢键可通过,DNA,连接酶连接起来。例如：,EcoRI,的识别顺序,5GAA,TT_C3,3C_TT,AAG5,.,型,：限制性内切酶有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。,结论：,型限制性内切酶的特性使它在分子克隆中得到了广泛应用，是重组,DNA,的基础。,.,3.,同裂酶和同尾酶,同裂酶,：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有,甲基化的核苷酸,时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。这些有相同切点的酶称为同裂酶。,同尾酶,：有时两种酶切割顺序不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过,DNA,连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。,.,4.,影响核酸限制性内切酶活性的因素,a.DNA,的纯化,b.DNA,的甲基化程度,c.,酶切消化反应的温度,d.DNA,的分子结构,e.,溶液中离子浓度及种类,f.,缓冲液的,PH,值,.,用,途,用于,DNA,基因组,物理图谱,的组建；基因的定位和基因分离；,DNA,分子碱基序列分析；比较相关的,DNA,分子和,遗传工程,。,.,电泳概述,带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的现象，称为电泳或离子泳。,基本原理,：交替溶液中的蛋白质、肽都具有可解离的基团，在溶液中形成带正电荷或带负电荷或咪唑基的质点。在,酸性溶液,中，由于,H,+,浓度较大，它能抑制蛋白质分子中的羟基解离出,H,+,，使更多的,-NH,2,接受,H,+,形成,-NH,2,+,，因此，在酸性溶液中，蛋白质带有较多的正电荷，在外加电场中，向负极移动；反之，在,碱性溶液,中，氢氧根离子中和羟基中的氢离子，蛋白质带有较多的负电荷，在外电场作用下，向正极移动。,.,分类,：按照分离原理的不同，可分为：区带电泳、移界电泳、等速电泳、等电聚焦电泳,应用,：生物学上的可移动大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等，具有可以电离的基团，在具有一定,pH,值的溶液中，能够形成带电荷的阳离子和阴离子，通过电泳方法可以将处于同一体系的不同组分分开。,.,凝胶电泳技术,凝胶电泳是以各种具有网状多孔结构的凝胶为支持物的电泳技术。同时，凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用，有很高的分辨能力。凝胶电泳的支持介质一般有以下几种：,（,1,）淀粉凝胶,（,2,）琼脂糖凝胶，适用于分离大分子核；,（,3,）聚丙烯酰胺凝胶，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核,酸。,.,凝胶电泳优点,(1),样品不易扩散,(2),制备简单，时间短；,(3),将分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，提高分辨能力；,(4),需要合成用的原料纯净，制成的多聚物的再现性高，因此样品分离的重复性也比较高；,(5),可以随意控制凝胶浓度，按需要可制作不同孔径的凝胶；,(6),一定浓度范围内透明性好，机械轻度好，有弹性；,(7),链上具有不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基，所以电泳时不会产生电渗；,(8),用途广泛，可以对核酸、蛋白质等生物高分子进行分离、定量、定性、分子量的测定；,(9),需要样品量少，,1-100g,已经足够。,.,琼脂糖凝胶电泳,琼脂电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一种电泳方法。该法主要用于研究核酸等大分子物质，是分子生物学中不可缺少的研究手段之一。,用琼脂糖胶分离双链,DNA,时，其迁移率大小，主要与样品的相对分子质量有关，而与核酸的一级结构一级碱基的组成无关。利用琼脂糖电泳分离和分析蛋白质和核酸的基本原理是,电荷效应,及,分子筛效应,。,.,以琼脂糖凝胶电泳实验为例，待测,DNA,片段与已知浓度的,DNA,片段同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，分析其含量：,1.,原理,溴化乙锭,(EB),在紫外线照射下能够发射荧光。当,DNA,样品在含有适量,EB,的琼脂糖凝胶中进行电泳时，其中插入到,DNA,分子中的,EB,与之形成荧光混合物，使,DNA,发射的荧光增强几十倍。荧光强度与,DNA,含量成正比关系。为了能够比较出待测样品的浓度，只需把已知浓度的标准样品作为琼脂糖凝胶电泳的对照。用肉眼可以检测到,0.010.1mg DNA,，薄层分析扫描仪可以检测到,510ng DNA,。,.,2.,仪器,紫外投射反射分析仪，电泳槽，电泳仪。,.,图,1,电泳槽,.,图,2,电泳仪电源,.,3.,试剂,(1)6,*上样缓冲液：,0.25%,溴酚蓝，,40%,（,W/V,）蔗糖水溶液；,(2)50*TAE,电泳缓冲液：,Trish,碱,242g,，冰乙酸,57.1ml,，,0.5mol/L EDTA100ml,，加水溶解后定量,1000ml,；,(3)5mg/ml EB,（溴化乙锭）：,0.5g EB,，,100ml,双蒸水。,.,4.,操作步骤,(1),称取,1g,琼脂糖凝胶干粉，加,100ml 1*TAE,电泳缓冲液，加热使琼脂糖熔化均匀，取出后室温冷却至,5060,；,（制作凝胶液）,(2),将胶倒入制胶槽中，并插入样品梳，待充分凝固后拔出样品梳；,（插梳子）,(3),将凝胶板放入电泳槽中，加入,1*TAE,电泳缓冲液，使液面略高于凝胶,1*TAE,电泳缓冲液；,（加电泳缓冲液）,(4)5l DNA,样品加,1l 6*,凝胶加样缓冲液，搅拌均匀后全部加入凝胶板的样品孔中；在另一加样孔中加,5l,已知片段大小的,DNA,标准溶液；,（上样）,(5),打开电源开关，电压,100V,，电泳约,3040,分钟；,（通电，跑电泳）,(6),取出泳动后的凝胶板，,EB,染色,20,分钟后才在紫外分析仪中观察,DNA,区带。,（取出凝胶，分析电泳结果）,.,一般情况下，实验后分析结果一般用肉眼观察，通过比较待测,DNA,的条带与已知,DNA,的各条带的,荧光密度,，估计待测,DNA,在凝胶中的含量和浓度。,.,谢谢聆听,!,.,感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络，,如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！,