多克隆抗体制备.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,.,*,多克隆抗体制备,.,多克隆抗体的制备方法,.,动物选择,一、,选择制备多克隆抗体,(,抗血清,),的动物种类应考虑的要点,:,需要制备的抗血清的质量,;,供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系,;,免疫动物产生的抗体特性,（,针对不同性质的免疫原选用相应的动物,）,。,二、,动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响,优先选取青壮年动物；,雌性动物的免疫应答状况,无论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈,。,.,家兔,家兔是最适合制备抗体的动物。,其体型适中,成年体重为,2,6kg,一次采血量可达,25,50ml,全放血量则达,100,180ml;,性格驯顺,易于操作和采血,;,寿命相对较长,为,5,8,年,;,能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清,；,通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体,；,家兔仅一型,IgG,而无亚型。用家兔的,IgG,很容易制备,Fc,、,Fab,和,F(ab,)2,等片段,.,鸡,鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质的抗体具有独特的优点。,鸡的,IgG,常称,IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体成分,C1,也不会与细菌蛋白,A,或蛋白质,G,、哺乳动物的,Fc,受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡,IgY,的稳定性不如家兔,IgG,不过,鸡的,IgY,在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品,IgY,在中性缓冲液和冷藏条件下则可保存数年之久。用鸡,IgY,已经制备出,Fc,和单价的,Fab,或,Fab,等片段。,鸡可将大量,IgY,输送入鸡蛋黄中,从鸡蛋中收获抗体可避免采用损伤性的收集手段。,.,免疫剂量,剂量：,免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约,0.5,1mg/,只，小动物约,0.1,0.6mg/,只。,如无免疫佐剂可适当提高免疫剂量（,10-20,倍）。,乳化：一般抗原与免疫佐剂体积比,1:1,混合。首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不完全佐剂。,（,1,）延长抗原释放时间；,（,2,）增加抗原的表面积；,（,3,）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（,4,）增强辅助,T,细胞的作用；,（,5,）刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。使无免疫原性物质变成有效的免疫原；,（,6,）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强,。,.,免疫方式,注射途径：,免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为,8,10,点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利,.,免疫方式,间隔与免疫时间：,第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和,b,细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔,10,20,天为好。二次以后每次的间隔一般为,7,10,天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。,免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血清滴度测定）,.,免疫应答,机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定免疫效应的过程。,(,一,),感应阶段,(inductive stage),称致敏阶段,(sensitization stage),，是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞,(APC),对其识别、捕获、加工处理和递呈，以及抗原特异性淋巴细胞,(T,细胞和,B,细胞,),对抗原的识别阶段。,(,二,),增生分化阶段,(proliferative and differentiative stage),又称反应阶段,(reactive stage),，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。,T,细胞增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应,T,细胞,(,或称致敏,T,细胞,),，并产生多种细胞因子；,B,细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分,T,、,B,淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞,(Bm,和,Tm),。在此阶段，有多种细胞间的协作和多种细胞因子的参加。,(,三,),效应阶段,(effective stage),此阶段是由活化的效应细胞,(CTL,与,TD,或,TDTH),和效应分子,(,抗体与细胞因子,),发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。,.,.,初次应答,(primary response),机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程称为初次应答，主要特点为：,机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和排出相对平衡，最后为下降期；,初次应答最早产生的抗体为,IgM,，可在几天内达到高峰，然后开始下降，接着才产生,IgG,，,IgG,抗体产生的潜伏期比,IgM,长，如果抗原剂量少，可能仅产生,IgM,，,IgA,产生最迟，而且含量少；,初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以,IgM,为主，且抗体的平均亲和力较低。,.,再次应答,(secondary response),机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体的过程称为再次应答或回忆应答,(anamnestic response),，主要特点为：,潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的一半；,抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍到几十倍，而且维持时间长；,诱发再次应答所需的抗原剂量极小；,再次应答产生的抗体主要为,IgG,，而,IgM,很少，抗体的平均亲和力高。如果再次应答间隔的时间越长，机体越倾向于只产生,IgG,。抗原物质如经消化道和呼吸道等粘膜途径进入机体，可诱导产生分泌型,IgA,，在粘膜表面发挥免疫效应。,.,血液采集,采血量,采血部位,少量,尾静脉，耳静脉，眼底静脉,中量,耳中央动脉，颈动,/,静脉，心脏,大量,股动脉，颈动脉，心脏，摘眼球,血清的分离：采取,4,静置过夜，,3000-4000,转离心,10-15min,钟。,.,多克隆抗体纯化,蛋白,A,亲和层析,蛋白,A,可与多种哺乳动物的,IgG,重链的,Fc,片段相结合也可与某些,IgM,和,IgA,相结合,抗原亲和纯化,多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种基质上，然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体，然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体，最后再将抗体洗脱下来,.,