HIV检测技术ppt课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,艾滋病检测技术,1,检测的重要性,任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者甚至对家庭和社会都产生十分重要的影响,艾滋病诊断的一项重要指标，也是控制,HIV,传播和控制艾滋病流行的重要手段,2,检测的目的,诊断,为确定个体,HIV,感染状况，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。,监测,为了解不同人群,HIV,感染率及其变化趋势，检测的人群包括各类高危人群和一般人群,血液筛查,为防止输血传播,HIV,而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,临床治疗和预后的判断,疗效观察和耐药性监测,3,HIV,感染的实验室检测,常用,HIV,病原学检测方法,:,病毒分离,抗原检测,核酸检测（,HIV,核酸定性检测,、,HIV-RNA,定量测定）,常用,HIV,抗体检测方法（均未能检测,N,型）,筛查实验方法,ELISA，,胶体金（硒），,PA,法，,斑点,EIA,，,唾液、尿液检测卡,，,化学发光免疫分析,确认实验方法,免疫印迹法，条带免疫法，放免法,间接免疫荧光试验,其他,CD4+/CD8+T cell,计数等,4,病毒感染后病毒,RNA,和血清标记水平,10,20,30,40,50,60,70,80,90,0,病毒,RNA,抗原或抗体水平,HIV-1,RNA,Ab,to HIV-1,p24 Ag,5,HIV,抗 体 检 测,方 法,酶联免疫吸附法,（,ELISA,）,最早出现、发展最快、至今仍普遍使用,很高的灵敏度和特异性,适合对大量样品的检测,可以进行很方便的质控工作，因此是目前临床最常用的筛查检测方法,6,酶联免疫吸附试验（,ELISA）,目前主要使用第三代抗,HIV,抗体1/2试剂（即双抗原夹心法）,第四代,ELISA,试剂可同时检测,P24,抗原和抗,HIV-1/2,抗体。与第三代抗,HIV-1/2,试剂相比，检出时间提前了4,9,d。,7,HIV ELISA,试剂的发展过程,8,第四代,ELISA,试剂,优点：缩短了窗口期,缺点：同时把抗原和抗体包被在反应板上，存在互相干扰的可能，检测的敏感性和特异性可能都会受到影响。第四代试剂检测,p24,抗原的敏感度,(20,100pg/m1),，单独检测,p24,抗原试剂的敏感度,(3.5,10pg/m1),。,9,HIV,感染窗口期,1,st,-2,nd,代,3,rd,代,=,Detection limit,2%,。另外，文献报道大约,4%,20%,的样品经过,HIV,初筛复检阳性后，,WB,结果为“不确定”。,WB,不确定结果的出现确实给临床诊断带来困难，需要更多的时间和实验进一步确认，也会对受试者造成额外的心理负担。从另一方面而言，,WB,不确定结果确是受试者真实的血清学反应。,39,HIV,抗体不确定,对于符合,HIV,抗体不确定判断标准，报告“,HIV,抗体不确定（,）”，在备注中应注明“,3,个月后复检”，同时进行以下处理：,(1),随访复检：每,3,个月随访复检,1,次，连续,2,次，共,6,个月。如果检测时暴露时间已超过,3,个月，则在,3,个月后随访,1,次即可。将前后,2,份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则报告,HIV,抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合,HIV,抗体阳性判定标准则报告,HIV-1,或,HIV-2,抗体阳性。,(2),必要时可做,HIV-1 P24,抗原或,HIV,核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。,40,HIV,抗体不确定,当出现任何,HIV,病毒特异条带，但不足以被判断为阳性则判定为不确定结果。不仅初筛阳性的标本可以出现不确定的结果，初筛阴性的标本经,WB,检测也有大约,15%,出现针对一个或几个抗原的不确定结果。,WB,不确定结果中,p24,条带最常出现（,60%91.6%,），,gp120/gp160,出现的频率其次。,WB,不确定结果出现原因比较复杂，与检测对象、检测试剂和实验操作有关，详见下表。,41,WB,不确定出现的原因,HIV,及相关感染：早期血清学转换、,AIDS,晚期、早产感染、,HIV,缺失株感染、免疫静止型,AIDS,、,HIV-2,感染、散发,HIV/SIV(,猴免疫缺陷病毒,),。,其它逆转录病毒感染：山羊关节炎,-,脑炎病毒,其它临床状态：自身免疫疾病（系统性红斑狼疮，原发性干燥综合征）、麻风病、恶性肿瘤、高胆红素、高核蛋白、高类风湿因子,无感染：,HIV,阳性母亲所生的正常婴儿、未筛查血液制品的接受者、疫苗试验志愿者、保持,WB,结果不变的供者,42,WB,不确定出现的原因,检测试剂：宿主细胞蛋白残留、判断准则、试剂盒的条件优化,/,稳定性,实验操作：交叉污染、试验程序、仪器设备、样本处理及溶血,43,其它确认试验,线性免疫试验：,将,HIV,的重组和合成多肽抗原包被在硝酸纤维素膜条上，用于检测样本中的,HIV-1,和（或）,HIV-2,抗体。该法可降低来自细胞培养的杂质蛋白污染而引起非特异反应，在欧洲应用广泛，大量研究报道称它的准确性与免疫印迹法相当。,44,其它确认试验,放射免疫沉淀试验：,用同位素标记的,HIV,蛋白与待检血清反应，若血清中含有,HIV,抗体即可与,HIV,蛋白抗原结合，再加入葡萄球菌蛋白,A,，经低速离心，然后将沉淀复合物分离后电泳，放射自显影观察同位素标记蛋白带即可判定。本法灵敏度和特异度均好，但因试剂制备复杂，成本高，且同位素操作需要严格防护而限制其应用。,45,其它确认试验,间接免疫荧光试验：,将,HIV,感染的细胞作为抗原固定在玻片上，再在其上滴加待检血清，若含有,HIV,抗体，则与细胞膜上的病毒抗原结合，清洗后加荧光标记的抗人,IgG,，洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下观察结果，胞浆内出现特异性荧光，而对照孔没有特异性荧光，就可诊断为,HIV,抗体阳性。此法操作简便，敏感性及特异性均较,ELISA,法高，但存在对某些血清非特异性荧光难以去除，结果判断需要荧光显微镜，需要受过良好训练的技术人员，对结果的观察和解释易受主观因素的影响，结果也不宜长期保存。,46,HIV,抗原的检测,窗口期：,HIV,感染人体后有一段窗口期，在这段时期病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。,HIV-1,感染机体后,感染者血液中最早出现的是病毒,gag,基因表达产物,p24,抗原,然后才出现相应的特异性抗,HIV,抗体,以后随抗体滴度的升高,p24,抗原含量呈逐渐下降的趋势以至检测不出。在病情发展到,AIDS,期，病毒大量复制，机体免疫力下降，所产生的抗体不足以中和病毒抗原时，,p24,抗原在血中又可检测出。,47,HIV,抗原的检测,阳性母亲所生育婴儿检测：,HIV,阳性母亲所生育的婴儿,30%,可能已受到感染，但由于婴儿体内母源性抗,HIV,抗体可持续,18,个月之久，常规检测抗,HIV,抗体须要在婴儿,18,个月以后才能确定婴儿体内的,HIV,抗体是来自母体，还是自身产生，而,HIV,抗原的检测则可弥补这一不足。,48,HIV,抗原的检测,HIV-1,抗体不确定,第四代,HIV-1,抗原/抗体,ELISA,试剂检测呈阳性反应，但,HIV-1,抗体确认阴性者的辅助诊断。,监测病程进展和抗病毒治疗效果,针对,HIV,抗体产生前的血液产品进行筛查,对,HIV,病毒暴露但血清学阴性的个人进行早期感染的检测,49,HIV,抗原的检测,联免疫分析（,ELISA,）,放射免疫分析（,RIA,）,免疫荧光技术（,IFA,）,免疫吸附电镜法（,Immunosorbent,Electron,Microscopical,method,，,ISEM,）,50,ELISA,检测,P24,抗原技术,检测,HIV,感染敏感的常规方法,双夹心抗体法（原理同双夹心抗原法）,假阳性高需用中和试验加以鉴别,51,ELISA,检测,P24,抗原改进技术,超敏感酶免疫测定法,(Ultrasensitive enzyme immunoassay,，,UEI),又称双位点免疫复合物转移酶免疫测定，基本技术路线是利用高亲和力抗体浓缩富集血清中的,P24,抗原，然后进检测。该法可将下限延伸至,0.2pg,ml,线性免疫酶测定,(1ineal,immunoenzymatic,assy,，,LIA),和,Cobas,Core,HIVCombi,EIA,是新近发展起来的第四代,HIV,检测技术。目前最敏感的抗原试剂盒的检测阀值为,0.01pg,ml,。,52,HIV,抗原检测局限性,p24,蛋白只是个临时标志，急性感染期之后就很快降低到无法检测的水平，只有在病人的,AIDS,阶段才重新出现,HIV-1 P24,抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，该结果仅作为,HIV,感染的辅助诊断依据，不能据此确诊,HIV-1 P24,抗原检测阴性只表示在本试验中无反应，不能排除,HIV,感染,53,HIV,核酸测定,HIV,核酸定性检测：,是否存在病毒核酸,HIV,核酸定量检测：,血液中病毒复制水平,54,HIV,核酸定性检测,血浆、血清或全血中,HIV-1 RNA&DNA,PCR&RT-PCR,方法,55,HIV PCR,检测的主要用途,婴儿,HIV,感染的诊断,检测,HIV,前病毒,DNA,是婴儿,HIV,感染诊断首选的方法，与病毒培养和随访的符合率达到,95-100%,。,HIV,感染的早期诊断,感染以后,1-2,周就可用,PCR,方法检测出,HIV,基因，比抗体出现的时间提前，使窗口期大大缩短，有利于早期诊断。,HIV,抗体检测不确定结果的诊断,有助于及时阐明,HIV,抗体的不确定结果是早期,HIV,感染还是非特异性反应，在迫切需要诊断结果的时候很有用处。,56,HIV DNA PCR,实验是婴儿,HIV,感染诊断首选的方法,HIV DNA PCR,方法是在新生儿期诊断,HIV,感染的一种敏感的方法,38,感染的孩子在出生后,48,小时,HIV DNA PCR,就可呈现阳性,在出生后第二周，检测的敏感性大幅度上升，,14,天时阳性率达到,93,28,天时阳性率是,96,，并且具有很高的特异性（大约,99,）,一次检测呈阳性提示可能存在,HIV,感染，应采集第二份标本重复病毒学实验以便进行确认。两次不同时间采集的标本,HIV,病毒学实验均为阳性即可得出,HIV,阳性的诊断,57,对,HIV,阳性母亲所生新生儿的检测程序是,：,出生后,48,小时进行第一次检测，大约,38,感染的婴儿可以在这个时期得出诊断,出生时检测为阴性的婴儿应在,14,天进行一次重复检测，因为病毒学实验检测的敏感性在,2,周时大幅度增加了,仍然阴性的婴儿应该在,1,2,个月时进行重复检测,出生时和,1,2,个月时病毒学检测为阴性的孩子应该在,3,6,个月时再次进行检测,58,HIV,核酸定量测定,辅助诊断,:,在一般情况下，,HIV,抗体检测足以对,HIV,感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯抗体检测不足以完成明确的判定，如出现某些非典型的抗体反应形式，特别是不确定反应时，,RNA,的测定可提供非常有用的证据。虽然单纯使用,RNA,测定不能完全确定感染与否，但当,RNA,测定出现较高拷贝数的阳性结果时（,3,，,000c/ml,），感染发生的可能性非常大。,每一种,RNA,定量系统都有其最低检测限，即可以测出的最低拷贝数，通常在,50,100c/ml,以上，,RNA,定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒,RNA,。另外，许多,AIDS,病人,/HIV,感染者在接受抗病毒治疗后其病毒载量可降至非常低的水平，还有少数,HIV,感染者在感染后长期处于病毒水平非常低的状态，进行,RNA,测定时往往测不出来。因此，使用此指标应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。,59,HIV,核酸定量测定,早期诊断,在,HIV,感染的窗口期无法使用抗体检测进行诊断。而在感染早期，在抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰，此高峰通常高于发病时的血浆病毒水平，并且有证据表明这个时期的病毒具有很高的感染能力。这个高峰在免疫系统产生反应后，尤其是在细胞免疫出现后开始下降。因此早期病毒,RNA,测定具有特殊的意义。该方法也可用于,HIV,感染孕妇所生婴儿的早期辅助诊断。,目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个样品混合后的,RNA,检测以减少窗口期危险（降低“残余危险度”）。,60,HIV,核酸定量测定,病程监控,根据,HIV,感染发生后病毒载量具有一定的变化规律，并且这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量的检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。,通常在,HIV,感染后无症状期内发生的感染或其它临床症状很难与,AIDS,发病时的症状区别，为确定一个刚发生的症状是否与,HIV,的感染有关，医生往往需要观察病人的实验室指标，病毒载量就是一个非常重要的指标。,61,HIV,核酸定量测定,指导治疗方案及疗效判定,临床实践证明，并非在任何情况下,HIV,感染者都应该进行抗病毒治疗。这不单是经济上的原因，更重要的是由于抗病毒药物的副作用和疗效原因。通常在病毒载量达到一定水平后（如,35,，,000,50,，,000c/ml,）抗病毒治疗才具有良好的效果。在进行治疗后，通过病毒水平的检测才能确定治疗是否有效，通常在治疗前后病毒水平降低,0.5 log,以上才被认为临床有效。,62,HIV,核酸定量测定,预测疾病进程,HIV,感染后疾病进程与病毒载量的关系十分密切，观察,HIV,感染者病毒,RNA,水平可大致预测其发病的可能。病毒载量与,6,年发病率的关系为：,30,，,000c/ml,时则为,80%,。当,HIV,感染者,CD4+T,细胞计数,200/l,时，病毒载量与,3,6,个月发展至,AIDS,的危险为：,10,，,000c/ml,为,4.9%;10,，,000,29,，,999c/ml,为,12.7%;30,，,000,99,，,990c/ml,为,17.7%;,100,，,000c/ml,为,22.4%,。在,CD4+,细胞数相同的情况下，年纪大的比年轻患者发展至,AIDS,的危险更大（,AIDS 2004,；,18,：,51-58.,）。,63,HIV,核酸定量测定,常用的,HIV RNA,定量测定方法,核酸序列扩增试验（,NASBA）,逆转录,PCR,试验（,RT-PCR）,分支,DNA,杂交试验（,bDNA,）,荧光定量,PCR,试验,64,核酸测定注意事项,标本类型,血浆和血清标本都可用来测定病毒载量，用三种测定方法进行比较都发现血清和血浆测定的结果有高度相关性。但是血清的检测结果大约是血浆的,50%,（,30-80%,），可能是因为血液凝固的过程中,HIV,颗粒被包裹在纤维蛋白网络中，导致血清中病毒的浓度下降。因此，测定病毒载量应该首选血浆标本，血浆也是临床使用的唯一标本。血清标本对于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的标本类型应始终保持一致。,65,核酸测定注意事项,抗凝剂,抗凝剂能够显著影响测定的结果。肝素钠处理的血浆不适合做,Amplicor,HIV-1 Monitor,试验，因为肝素是,PCR,反应的一个潜在的抑制剂。如果必须用,RT-PCR,方法测量肝素处理的血浆，可以向标本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素处理的血浆中病毒颗粒降解的速率显著高于,EDTA,钠盐和枸橼酸钠处理的血浆，一般情况下不同抗凝剂处理的血液,6,小时之内,HIV RNA,的降解速率分别是,1.8%/,小时（,EDTA,）、,3.3%/,小时（枸橼酸钠）和,5.0%/,小时（肝素）。在血液处理方法相同的条件下，用,EDTA,钠盐抗凝的血浆结果显著优于枸橼酸钠和肝素，因此,EDTA,钠盐是首选的抗凝剂。,66,核酸测定注意事项,标本处理时间和温度,HIV-1,在体内进行快速转换，平均半衰期是大约,6,个小时。,HIV-1,在体外未处理的全血中也快速降解，全血中,HIV RNA,的降解速率在,6,小时之内平均是,9%,（,0.04log,）,最大的降解速率是在采血以后,6-8,小时，采血以后,30,小时内可能减少,0.5log,。因此为了减少病毒颗粒降解对检测的影响，应该在采血以后,6,小时之内分离血球和血浆，如果做不到就应该使用血浆分离管，立即离心,4,存放，需要保存,30,小时以上就应该放在,-70,。,温度对,HIV RNA,的影响不显著。,-70,室温反复冻融,3,次，,HIV RNA,变化的幅度小于,0.2log,。,-70,保存,5,个月，,HIV RNA,减少,0.3-0.5log,，,-70,保存,12,个月，,HIV RNA,减少一般不超过,0.4log,。血浆在室温或,4,保存,3,天，,HIV RNA,减少不超过,0.5log,。,67,CD4,细胞检测,CD4+T,淋巴细胞计数测定的主要意义,用于,HIV,感染者的疾病分期：,CD4+T,淋巴细胞0/,mm,3,艾滋病期,判断,HIV,感染者的临床合并症,各种机会性感染与,CD4+T,淋巴细胞的相关性。,帮助确定抗,HIV,药物治疗及机会性感染预防性治疗,的适应症,抗,HIV,药物疗效的重要判断指标。（周后上升）,68,与艾滋病相关的免疫细胞检测,艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，主要表现为患者免疫功能低下。对,HIV,感染者与艾滋病患者进行免疫学功能检测感染者免疫状况，有助于预测判断疾病进程、评价抗病毒药物治疗效果和估测预后。与艾滋病相关的免疫细胞检测指标主要,CD4+T,淋巴细胞数目、,CD8+T,淋巴细胞数目以及,CD4+/CD8+,的比例，更为精细的指标还包括,NK,细胞、,B,淋巴细胞、,HIV,特异性,T,细胞等。其中最重要的指标为,CD4+T,淋巴细胞数目。,AIDS,是由,HIV,引起的一组综合征，,HIV,主要侵犯人,CD4+T,淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。因而，对,HIV,感染者和,AIDS,病人定期进行,CD4+,、,CD8+T,淋巴细胞 检测具有十分重要的意义。,69,CD4+,、,CD8+T,淋巴细胞检测意义,了解机体的免疫状态以进行疾病分期，以如美国,CDC,就是以此为基础制订了,HIV,感染者,/AIDS,病人的诊断和分类标准（见表,1,），目前国内外仍被采纳应用。我国,国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册,中将,CD4+T,淋巴细胞,CD4350/,l,作为开始抗病毒治疗的标准。,70,CD4+,、,CD8+T,淋巴细胞检测意义,长期监测,CD4+T,淋巴细胞绝对数的变化，有助于了解患者的病情发展，决定正确的治疗方案，并观察对治疗的反应。如判断,HIV,感染者的临床合并症（如当,CD4+T,淋巴细胞细胞,200/,l,时，很容易发生卡氏肺孢子虫肺炎）。,71,CD4+,、,CD8+T,淋巴细胞检测意义,帮助确定抗,HIV,药物治疗及预防机会性感染治疗的适应症，如当,CD4+T,淋巴细胞,200/,l,时，应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预防性治疗。,72,CD4+,、,CD8+T,淋巴细胞检测意义,是用来评价一些新的、针对,HIV,的治疗方法和治疗药物疗效的重要指标。（周后上升）,73,CD4,检测,注意事项,抗凝管：,K3EDTA,采血时间：某个相同的时段。如：每次采样时间均在上午或均在下午。,温度：,18-25,保存和运输样品,运送时间：样品应在,48,小时之内送达检测实验室,74,HIV,诊断试剂临床质量评估方案,75,评估目的,对国内市场销售的国产和进口的,HIV,诊断试剂的敏感性、特异性、批间差异和适用性进行综合质量评估，及时发现和解决试剂质量问题；,为中央和地方卫生行政部门提供有关的决策依据，并作为艾滋病实验室选择试剂的依据。,76,评估组织形式,国家级评估,国家艾滋病参比实验室（简称参比实验室）负责组织全国的,HIV,诊断试剂临床质量评估，选择部分具备资质的艾滋病确认中心实验室和确认实验室参与评估。每年至少组织1次。,77,评估组织形式,省级评估,省艾滋病确认中心实验室为各省,HIV,诊断试剂临床评估的主要职能单位。由省艾滋病确认中心实验室组织评估本省使用的,HIV,诊断试剂质量，选择省内艾滋病确认实验室或具备资质的艾滋病筛查中心实验室参与评估，每年至少组织1次。,78,评估程序,样品的组成和采集,目前常用的是200份,包括,已知样品和未知样品,各100份。,79,评估程序,样品的组成和采集,已知样品,系经,WB,确认的血清（浆），其中包括,HIV,抗体阴性（含筛查假阳性样品）、阳性和弱阳性样品。由参比实验室提供50份，参评实验室提供50份。一般阳性样品的比例为10%-40%。,80,评估程序,样品的组成和采集,100份,未知样品,，由参评实验室在本地区具有一定比例,HIV,阳性者的高危人群中采集。或由,HIV,感染率高的地区向,HIV,感染率低的实验室提供部分样品。,81,评估程序,样品质量,考核样品必须清亮、无溶血、无微生物污染，也无过多脂质，避免反复冻融。,82,试剂的品种及抽检,试剂种类,应尽可能覆盖临床使用的所有品种,83,试剂的品种及抽检,避免偏性,受评估试剂应由参评实验室从市场上或从筛查实验室进行随机抽检，保证其真实性。实行双盲检验，即操作者不知设计安排者选用样品的真实情况。,84,试剂的品种及抽检,参比试剂,可以选用一种或一种以上高质量的,HIV,诊断试剂。,85,质评样品的检测,最佳条件下进行比较实验,即在同一实验室采用统一的技术方法、仪器设备、由同一批检测人员严格按照各试剂操作要求进行评估。,86,评估结果的分析及统计处理,统计指标,敏感性,：真阳性/（真阳性+假阴性）100%,特异性,：真阴性/（真阴性+假阳性）100%,假阳性率,：假阳性/（真阴性+假阳性）100%,假阴性率,：假阴性/（真阳性+假阴性）100%,功效率,：,（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）,_ 100%,变异系数（,cv）,：,cv,=(s/x,),100%,PPV,=,真阳性/（真阳性+假阳性）100%,NPV,=,真阴性/（真阴性+假阴性）100%,87,评估结果的收集、分析、上报和反馈,88,thanks,89,