植物组织培养.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/23,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/23,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2019/12/23,#,植物组织培养,徐,省培项目,1,Objectives,课程目标,了解植物组织培养的基本原理及概念,了解植物组织培养的应用,掌握培养基配置方法,掌握无菌操作技术（进行花菜花柄的试管苗诱导）,测试不同植物激素对黄瓜子叶与下胚轴诱导愈伤组织及分化的影响,了解组培苗驯化移栽方法,掌握铁皮石斛人工种子制作,2,问题,植物自然条件下的繁殖方法有哪些？,种子繁殖,无性繁殖,3,各种形态的种子,4,种子和果实的产生,5,无性繁殖,6,植物组织培养的基本原理,1902,年，德国植物学家哈伯兰特,细胞全能性,的理论是,植物组培,的理论基础。,1958,年，美国植物学家,斯,蒂瓦特,等人，用胡萝卜,韧皮部,的,细胞,进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。,7,细胞的全能性,1,什么是细胞的全能性？,2,为什么细胞具有全能性？,3,各细胞的全能性一样吗？,8,定义：,1902,年由,Haberlandt,提出，即：,植物体的每一个具有完整细胞核的活细胞，都具有该植物所特有的全部遗传信息，在适当的条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。,20,世纪,80,年代，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。,植物细胞的全能性（,Totipotency,）,9,细胞全能性的相对性,:,细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生植物；,动植细胞全能性的表现程度存在明显的差异。,10,细胞按照分裂能力分为三类,:,第一类：始终保持分裂能力。如茎尖、根尖及形成层细胞；,第二类：永久失去分裂能力的终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；,第三类：在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。,11,根据细胞类型不同从强到弱,:,营养生长中心,形成层,薄壁细胞,厚壁细胞（木质化细胞）,特化细胞（筛管、导管细胞）,根据细胞所处的组织不同从强到弱：,顶端分生组织,居间分生组织,侧生分生组织,薄壁组织（基本组织）,厚角组织,辅导组织,厚壁组织,12,细胞全能性,脱分化,个体再生,再分化,细胞分裂,细胞全能性的实现是通过细胞脱分化和再分化实现的。,在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。,13,二、植物组织培养技术,1,培养条件,14,KNO,3,1900 MnSO,4,.4H,2,O 22.3 NH,4,NO,3,1650 H,3,BO,3,6.2 KH,2,PO,4,170 KI 0.83 MgSO,4,.7H,2,O 370 ZnSO,4,.7H,2,O 8.6 CaCl,2,.2H,2,O 440 Na,2,MoO,4,.2H,2,O 0.25 Na,2,.EDTA 37.3 CuSO,4,.5H,2,O 0.025 FeSO,4,.7H,2,O 27.8 CoCl,2,.6H,2,O 0.025,盐酸硫胺素（,V,B1,）,0.1,烟酸（,V,B5,或,V,PP,）,0.5,盐酸吡哆醇（,V,B6,）,0.5,肌醇,100,甘氨酸,2,蔗糖,30000,琼脂,10000,2,，,4-,二氯苯氧乙酸（,2,，,4-D,）,0.055,萘乙酸（,NAA,）,0.055,6-,苄基腺嘌呤（,6-BA,）,0.0510,MS,培养基配方 单位（,mg/L,）,15,二、植物组织培养技术,1,培养条件,营养物质,蔗糖,无机盐,维生素,水,有机物,氨基酸,细胞分裂素类,植物生长调节剂,生长素类,赤霉素类,无机物,有机营养,凝固剂,琼脂,环境条件,温度,湿度,pH,无菌,光照,一般控制在,23,28,操作台、培养基、实验仪器等,一般控制在,70,80%,一般控制,5.8,16,2,植物组织培养过程,脱分化,愈伤组织,再分化,根,芽,植物体,离体的植物器官、组织或细胞（外植体）,胚状体,17,叶片接种到培养基上,产生愈伤组织,愈伤组织增殖,愈伤组织开始分化,愈伤组织分化出芽,培养基中的试管苗,植物组织培养过程示意图,18,3,植物组织培养的概念,植物组织培养是利用植物体的离体器官、组织或,细胞，无菌条件下在含有营养物质的培养基上，给予,适宜的光照、温度、湿度等环境条件下进行人工培,养，使其增殖、生长、发育而形成完整的植株。,19,植物组织培养的几个概念,愈伤组织 原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。主要由薄壁细胞构成。,胚状体 指离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物。,培养基 供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。,无菌操作 用于防止微生物进入培养基和植物体的操作技术称为无菌操作。,植物激素 是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并自产生部位移动到作用部位，在极低浓度下就有明显的生理效应的微量物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素。组培中常加入植物激素或人工合成激素类化合物调节器官分化。,20,植物组织培养过程,脱分化,愈伤组织,再分化,根,芽,植物体,离体的植物器官、组织或细胞（外植体）,胚状体,21,探究活动：探讨影响植物细胞脱分化和再分化的因素,资料,1,在快速繁殖颤杨时，如果我们将一个枝条平均分成三段，结果发现，靠近顶端的那一段枝条的侧芽离体培养时繁殖系数最高，中间的次之，基部的最低。,结论：外植体在植株上的着生位置对其脱分化及再分化有一定的影响。,22,探究活动：探讨影响植物细胞脱分化和再分化的因素,资料,2,在,MS,培养基中加入质量分数为,0.5mg/L,的,6-BA,和质量分数为,0.5mg/L,的,NAA,，可诱导胡萝卜形成愈伤组织；在,MS,培养基中加入质量分数为,2mg/L,的,KT,（激动素）和质量分数为,0.2mg/L,的,NAA,，可诱导胡萝卜生出丛芽；在,MS,培养基中加入质量分数为,0.1mg/L,的,NAA,，可诱导胡萝卜生根。,结论：生长素及细胞分裂素的比例可影响细胞的脱分化及再分化。,23,探究活动：探讨影响植物细胞脱分化和再分化的因素,资料,3,将外植体培养在黑暗条件下，,10,天左右即可形成高度液泡化的愈伤组织，但是若将外植体培养在光照条件下，发现细胞分化产生维管束等组织，而不形成愈伤组织。,结论：愈伤组织的形成需要避光。,24,探究活动：探讨影响植物细胞脱分化和再分化的因素,资料,4,研究烟草组织培养时发现，烟草芽的形成以,28,为好，在,12,以下，,33,以上形成率均很低。,结论：脱分化及再分化都需要在适宜的温度条件下进行。,25,一、培养基配制,26,培养基的成分,无机盐类,维生素类,氨基酸,有机,附加,物,糖类,水,琼脂,植物,生长调节,物质,27,培养基配制程序,配制母液（大量 微量 铁盐 有机 植物激素）,加热溶解琼脂及糖,加入各类母液,定,容,调,pH,分装,灭菌,28,选修一教材相关问题,组织培养过程中蔗糖的吸收方式？,不,耐高温的试剂如何添加到培养基中？,为何铁盐母液单独配制？,为何要调整,pH,？,选修,一菊花组织培养中芽诱导及生根培养基的差异？,29,蔗糖吸收,1,、高压灭菌水解,2,、细胞壁蔗糖酶分解,3,、主动吸收,30,过滤灭菌,31,铁盐母液,铁盐母液制备：,3,价或,2,价铁盐分别加热溶解后混合定容,最终螯合铁大多以三价铁存在,。但植物细胞从,EDTA,吸收铁在细胞膜上由,3,价铁转化为,2,价铁。,32,33,实验一：培养基配置,花菜花茎段诱导培养基，黄瓜诱导愈伤及分化培养基,1,）：,MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0,mg/L+30g/L,蔗糖,+7,g/L,琼脂粉，,pH5.8,黄瓜诱导愈伤及分化培养基,2,）：,MS+NAA 2mg/L+6-BA 0.2mg/L+30g/L,蔗糖,+7,g/L,琼脂粉，,pH5.8,每组配上述两种培养基各,800ml,，每人准备,5,支试管倒第一种培养基，,3,支试管倒第二种培养基。,步骤：,1,、在搪瓷量杯内加入,500ml,去离子水。,2,、称取,800ml,所需,MS,培养基粉剂置于搪瓷量杯中。,3,、加入所需植物激素母液。,4,、加入所需蔗糖及琼脂。,5,、置于电磁炉上加热至沸腾。,6,、定容至,800ml,。,7,、调节,pH,至,5.8,。,8,、试管分装。,9,、灭菌,121,15min,。,34,植物再生植株的方式,器官分化途径,胚状体途径,试管扦插途径,35,外植体的成苗途径,36,来自于叶组织,来源于根,来源于维管组织,来源于胚组织,37,器官分化途径,烟草愈伤组织对不同生长素和细胞分裂素比值下不同的分化反应,38,外植体的成苗途径,39,40,愈伤组织来源的体细胞胚再生过程（间接体细胞胚发生）,41,直接体细胞胚发生,42,从一个细胞发育成一个植株,43,双子叶体细胞胚发育的三种形态,A,球形期,B,心形期,C,鱼雷期,44,试管外生根,45,芽,-,芽再生,46,节培养,47,小鳞茎、小球茎的诱导,48,微嫁接技术,49,Horizontal genome transfer as an asexual path to the formation of new species,Narure 2014,Vol.5 1 1,232-236,50,51,52,53,54,影响愈伤组织形态发生的因素,55,浙江高考理综,2010,56,培养基,1,）：,MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+3%,蔗糖,+0.7%,琼脂,PH=5.8,培养基,2,）：,MS+NAA2mg/L+6-BA0.2mg/L+3%,蔗糖,+0.7%,琼脂,PH=5.8,实验三 不同植物激素对黄瓜子叶与下胚轴诱导愈伤组织及分化的影响,一、实验目的,1.,了解不同组织对相同激素配方的响应,2.,了解不同激素对外植体愈伤组织及分化的影响,二、实验原理,同一植物不同组织诱导愈伤组织及其分化受外植体来源及培养基配方的影响。,三、实验步骤,1,、在超净台上取无菌滤纸一张置于台面上，打开兰花培养瓶，用镊子夹取一幼苗置于滤纸上。,2,、用解剖刀切下,子叶上部,、,下部,及,带子叶节的胚轴,，分别接种于上述培养基中。子叶背面朝下，下胚轴斜插于培养基上。,3,、根据不同培养时间记录不同培养基上上子叶、下子叶及下胚轴愈伤组织发生情况及芽诱导情况制表并填写，同时拍照记录。,57,三、植物组织培养技术的应用,1,、植物的快速繁殖,58,2,、培育无病毒植株,选取分生组织的生长点细胞（如茎尖）,3,、制造人工种子,胚状体经特定的物质包被,59,4,、培育作物新品种,单倍体育种,培育转基因植物,5,、工厂化生产细胞产物,60,细胞悬浮培养,植物细胞的悬浮培养（,Suspension culture,）是从愈伤组织的液体培养的基础上发展起来的一种培养技术，与用发酵罐培养微生物相类似，用生物反应器进行植物细胞悬浮培养的理想状态。,61,Callus induction,Suspension initiation,62,细胞悬浮系的建立,63,原生质体培养与植物细胞工程,植物细胞工程：以植物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，改变细胞的某些生物学特性，从而改良品种加速繁育植物个体或获得有用物质的技术（百度百科）,64,植物原生质体（,Protoplast,）是被去掉细胞壁的由质膜包裹着的、具有生活力的裸细胞。,65,66,Mechanical method of protoplast isolation,机械法分离原生质体,67,Principle steps in enzymatic isolation,酶法分离原生质体示意图,68,过滤漏斗,原生质体的纯化与培养,69,原生质体到细胞团过程,70,细胞团到愈伤组织至完整植株,71,细胞融合技术（原生质体分离）,72,73,通过农杆菌侵染的转基因技术,74,组织培养中次生代谢产物的获得,75,通过生物反应器大量生产毛状根,76,冰冻种质保存技术（悬浮细胞）,77,1,、用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培,养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是（）,A,该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的,B,该愈伤组织的细胞没有全能性,C,该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成,D,该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构,构,习题,B,78,2,、将胡萝卜形成层的细胞培养成幼苗时，下列条件中不需要的是（）,A,具有完整细胞核的细胞,B,一定的营养物质和植物激素,C,离体状态,D,导入特定基因,习题,D,79,3,、在下列选项中，没有采用植物组织培养技术的是（）,A,利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，得到多倍体植株,B,利用花药离体培养得到单倍体植株,C,利用基因工程培育抗寒的番茄植株,D,利用细胞工程培育,“,番茄,马铃薯,”,杂种植株,习题,A,80,实验二,花菜花茎段的诱导,81,82,83,84,85,86,87,教材相关问题,多少酒精消毒时间合理？,带一,片叶片意味着什么？,菊花快繁是否一定经历愈伤组织阶段？,88,2015,年,9,月浙江省新高考测试卷,89,2015,年,10,月浙江省选考,90,浙江省,2016,年,4,月选考题,91,三、试管苗驯化与移栽,92,试管苗的生态环境,高温且,恒温,高,湿,弱,光,无菌,气体环境,93,试管苗的特点,叶片解剖结构：海绵细胞层增加而栅栏组织较差，表皮的蜡质层减少，气孔发育,差且,开关能力低下。,生理,：组培苗的气孔保卫细胞的含钾量低，叶片的光合作用能力低。,根系,发育：一般无根毛或根毛发育极差，根系,对基质的附着能力,较差。,抗性,：抗病能力差，易感病死亡。,由于试管苗的上述特点，因此幼苗移栽入土后极易失水死亡。,94,试管苗的驯化,驯化的目的，在于提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力，,促使,试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。,驯化的原则，应从温度、湿度、光照及有无菌态等环境要素进行，驯化开始数天内,，应和,培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的栽培条件相似，从而达到逐步,适应的目的。,尽可能采用无糖培养技术。,95,96,97,被动式通气系统,98,主动式通气系统,99,涉及无糖培养技术的高考题,2010,浙江理综,100,铁皮石斛移栽与驯化,101,102,103,日常管理,灌溉：,1,、水质要求：如果用自来水必须提前一天接好自来水，暴晒,1,天，让氯气挥发出去。,2,、浇水时间：早上太阳照射前或晚上太阳照射后，最好是早上。,3,、浇水量：一次性浇透，直至栽培盆底持续滴水。,4,、浇水方式：用喷雾器雾化浇水，主要把水分浇在叶面上而不是基质上。,5,、当苗存活后，大约到,2,3,个月可以适当多浇水。,光照说明,1,、光照时间：光照时间和浇水量是相互作用的，如果基质浇水后不容易干，要适当,增加,光照时间，光照时间,2,5,个小时，视环境而定。,2,、光照环境：家庭种植最好放阳台（可以通风），但切记勿淋雨，阳台配置遮阴网,或者,透明塑料膜后（遮光率在,70%,左右最佳）。,3,、环境选择：如果不能配置遮阴网或者透明塑料膜，最好选择阳光直射,2-3,个小时,，而,不是放在阴暗处。这样有利于水分蒸发。,104,4,、人工种子,105,植物人工种子,是指将植物离体培养中产生的胚状体，包裹在,含有,养分和具有保护功能的外种皮中，使其在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒。现在已经,扩大到,包括包裹芽体、小鳞茎等,。,人工种子与天然种子非常相似，都是由具有活力的胚胎，营养物（人工胚乳）和,具有保护,功能的外部结构（种皮）构成的颗粒体。人工种子能大量、快速制备，不占耗地、,周年生产,、成本低，利用人工种子可以固定杂种优势，制备脱毒种子。,在人工种子中加入菌肥、有益微生物、抗生素、除草剂、植物生长调节剂等，更,有利于,培育壮苗。用于制作人工种皮的材料有聚氯乙稀、海藻酸钠、明胶、树胶等。人工,种子含水量,大，容易萌发，但贮存难度较大。,106,107,108,109,110,铁皮石斛的蒴果和种子,111,铁皮石斛组培过程,1.,种子无菌播种,112,铁皮石斛胚状体发育过程,2.,铁皮石斛种子形成原球茎,113,3.,铁皮石斛分化成苗,114,4.,移栽,115,人工种子,显微镜下石斛种子,铁皮石斛原球茎,悬浮培养,人工种子包埋,无菌状态萌发,开放式萌发,116,实验四 铁皮石斛人工种子制备,1.,人工种胚的获得,铁皮石斛种子通过无菌播种后可获得大量种胚原球茎。取长度介于,0.6-2mm,之间的,原球茎,包埋制种,。,2.,包埋,将筛选的原球茎,置于,4%,藻藻酸钠和,MS,培养基混合凝胶混匀，用无菌宽口滴管吸取,胚状体,，滴入,2%CaC12,溶液中，便可形成人工种子小球,。,3.,人工种子的萌发及植株再生,若包埋采用无菌方法，可将人工种子播种在含有,1/2 MS,琼脂培养基的培养皿，石,蜡膜封口,，,2000Lx,连续光照，,251,温度萌发。以突破种皮,2mm,为萌发标准，定期观察,萌发率,。待萌发后，置于黑暗中，以促进根的形成,。,（,3,不做）,117,2015,浙江高考模块,17,题,118,人教版选修一,119,谢 谢！,120,