PCR-技术及应用PPT课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,聚合酶链式反应技术及其应用,PCR,反应基本原理,1985,年，美国,Cetus,公司人类遗传研究室的年轻科学家,Kary.B.Mullis,在迥然灵感的启迪下发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（,Polymerase Chain Reaction,PCR,），实现了人们在体外无限扩增,DNA,片段的梦想。而,Saiki,首次应用,PCR,法成功的扩增了人,-,珠蛋白,DNA,，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断,。,PCR,反应基本原理,Mullis,在建立,PCR,发明的初期，仅采用非常简单的三种温度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌,DNA,聚合酶,的,Klenow,片段来催化复性引物的延伸效应。由于该酶会在进行,DNA,变性的温度下失活，所以每一轮反应中都要添加一次酶，扩增片段的长度受到限制，操作繁琐。,1988,年，,Saiki,把一种耐热的,DNA,聚合酶（,Taq DNA,聚合酶）引入,PCR,后，,PCR,技术的应用进入了实用阶段，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,热循环仪，使该技术的自动化成为现实。,PCR,技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中的应用越来越广，据文献报道,PCR,技术用于检测病原体的种类已超过,100,多种。,PCR,反应基本原理,PCR,是体外酶促反应合成特异性,DNA,的一种方法,.,它利用人工合成引物介导的,DNA,聚合酶促反应,扩增位于两段已知序列之间的,DNA,片段,.,主要步骤为,:,人工合成一对寡核苷酸引物，与待扩增,DNA,片段两条链的两端分别互补，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，循环进行，使目的,DNA,得以迅速扩增。由此可见，,PCR,就是在引物介导下反复进行,“,热变性,-,复性,-,延伸,”,而扩增,DNA,的循环过程。,DNA,变性及复性图解,PCR,原理,PCR,原理,变性,PCR,原理,复性,PCR,原理,延伸,PCR,原理,2,变性,PCR,原理,2,复性,PCR,原理,2,延伸,PCR,原理,3,变性,PCR,原理,3,复性,PCR,原理,3,延伸,DNA,以指数形式扩增(2,n,),，,其中长片段以线性形式扩增(2,n+2),，,最终主产物片段长度在两个引物之间。,预变性,(92-95,C,2-5m),变性,(92-95,C,30s),复性,(40-60,C,30s),延伸,(72,C,30-60s),总延伸,(72,C,7m),(25-35),经过,30,次的循环,扩增的,DNA,片段可达,100,万倍以上。,240,16,256,114,52,22,8,2,0,0,短片段（单链）,14,12,10,8,6,4,2,长片段（单链）,128,64,32,16,总片段（单链）,循环数,PCR,的一般过程：,PCR,条件的选择,进行,PCR,反应必须具备以下几个条件：,.,模板,DNA,.,人工合成的寡核苷酸引物,.,合适的缓冲体系,.,镁离子,.,4,种脱氧核糖核苷三磷酸,.,耐热,DNA,聚合酶,.,温度及循环参数,PCR,条件的选择,模板,DNA,：,PCR,反应可以以,DNA,或,RNA,为模板进行核酸的体外扩增，模板,DNA,的来源及其制备的效率对,PCR,扩增有重要的影响。临床检测用模板,DNA,来源必须根据检测的病原体不同选择最适部位，以取材方便，待测病原体含量高为原则。,PCR,条件的选择,引物：,PCR,反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所选择的引物序列决定了,PCR,产物的大小、位置、扩增区域的,Tm,值等。,引物设计的长度一般为,15-30,个碱基，引物长点，反应的特异性相对好，引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引物短点，它退火结合到靶,DNA,上形成供,DNA,聚合酶结合的稳定双链模板的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。,引物的末端核苷酸：引物及引物间,3,末端不能出现互补，引物间的互补容易导致引物双链体的出现。,合理的,GC,含量和,Tm,值：引物的,G+C,含量一般要保持在,50%,左右，,Tm,值,50%-70%,，,Tm,值低，扩增的特异性下降，若采用太高的退火温度，,Tm,值低的引物对可能不发挥作用。,PCR,条件的选择,避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物,3,端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败。,引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,引物量：每条引物的浓度,0.1,1umol,，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,PCR,条件的选择,DNA,聚合酶,在其它参数最佳时，每,100ul,反应液中含,1-2.5U(,比活性为,20U/pmol)Taq DNA,聚合酶为佳。然而，酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化,PCR,时，最好在每,100ul,反应体积中加入,0.5-5U,酶的范围内试验最佳酶浓度。如果浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。,dNTP,的质量与浓度：,dNTP,的质量与浓度和,PCR,扩增效率有密切关系，一般将其,PH,调节到,7.0,7.5,，小量分装，,-20,冰冻保存。多次冻融会使,dNTP,降解。在,PCR,反应中，,dNTP,应为,50,200umol/L,，尤其是注意,4,种,dNTP,的浓度要相等,(,等摩尔配制,),，如其中任何一种浓度不同于其它几种时,(,偏高或偏低,),，就会引起错配。浓度过低又会降低,PCR,产物的产量。,dNTP,能与,Mg2+,结合，使游离的,Mg2+,浓度降低。,Mg2+,浓度：在,PCR,体系中随各反应的需要而定，其浓度是否合适会极大地影响,PCR,的结果。所以一般要求每一个反应都预先经过一定的实验（,Mg,浓度梯度实验），以确定本实验的最佳,Mg,浓度，它是保证,DNA,聚合酶具有良好活性的必要条件。,Mg2+,对,PCR,扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的,PCR,反应中，各种,dNTP,浓度为,200umol/L,时，,Mg2+,浓度为,1.5,2.0mmol/L,为宜。,Mg2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低,Taq DNA,聚合酶的活性，使反应产物减少。,缓冲液：目前最为常用的缓冲体系为,1050mmol/L Tris-HCL(pH8.3-8.8,20).Tris,是一种双极性离子缓冲液，反应液中有,50mmol/L,氯化钾，有利于引物与模板的退火。高于,50mmol/L,氯化钾，或,50mmol/L,氯化钠，对,Taq DNA,聚合酶有抑制作用。明胶或,BSA,以及非离子去污剂,Tween20,等，对,Taq DNA,聚合酶能起稳定作用。,引物及,dNTP,的优化,酶及溴酚蓝的优化,PCR,反应的最佳模式（,CT,为例）,CT DNA PCR,最佳反应体系：,反应混合物终浓度,20,反应缓冲液,1,dNTP,混合物,200,M,引物,15pmol,引物,15pmol,MgCl,2,溶液,2.0mM,无菌去离子水至,26,l/,反应管,取,26,l,反应混合物，加入已经分装的,Taq DNA,聚合酶,1u,（固定化的酶）的离心管中，加入,2,l,待测,DNA,模板，混匀，铺上石蜡，,37,保温,10,分钟，然后进行,PCR,循环：,94 300,秒,94 45,秒,55 45,秒,35,次循环,72 45,秒,72 300,秒,PCR,反应的特点,特异性高：以探测基因为目标，属于,“,病因诊断,”,，针对性强，对多种传染病，根据,PCR,检测结果可以确诊。对于那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体如梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等，采用,PCR,检查来确定感染就特别有效,PCR,反应的特点,灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（,ELISA,）和放射免疫分析（,RIA,）其灵敏度分别为,ng,和,pg,级，而,PCR,检测灵敏度可达,fg,级，理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在；,PCR,反应的特点,简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加样后即可进行扩增，许多,PCR,检查项目在两小时左右即可出报告；对样品要求低：几乎所有的临床标本都可用于,PCR,扩增。,PCR,技术的用途,科研使用,临床医学,法医学 个体识别与亲子鉴定,农业,GMO,考古学,人类学,环境保护,PCR,应用类型,一、不对称,PCR(asymmetric PCR),不对称,PCR,的目的是扩增产生特异长度的单链,DNA,。,PCR,反应中采用二种不同浓度的引物，,PCR,结果产生大量单链,DNA,。因,PCR,反应中使用的二种引物浓度不同一步法，因此称不对称,PCR,，此法产生的单链,DNA,可用作杂交探针或,DNA,测序的模板。,进行不对称,PCR,有二种方法：,(1),一步法,;(2),两步法，第一次,PCR,用等浓度的引物，以期获得较多的目的,DNA,片段，取第一次扩增产物,(,含双链,PCR,片段,),用单引物进行第二次,PCR,扩增产生单链,DNA,。,二、逆转录,PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR),RT-PCR,先在逆转录酶的作用下以,mRNA,为模板合成,cDNA,，再以,cDNA,为模板加入,dNTP,和两种特异引物及,Taq,酶进行,PCR,反应，这样低丰度的,mRNA,被扩增放大易于检测。,RT-PCR,中的关键步骤是,RNA,的逆转录，要求,RNA,模板必须是完整的，且不含,DNA,、蛋白质等杂质。,RT-PCR,图解,三、锚定,PCR(anchored PCR,A-PCR),该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行,PCR,扩增。,四、反向,PCR(inverse PCR,IPCR),IPCR,是扩增未知序列的一种简捷方法。其基础是：用限制性内切酶消化,DNA,，然后环化切割的产物，再用切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行,PCR(,图,8-3),，也可将环化,DNA,线性化后再进行,PCR,。,五、随机引物,PCR(arbitrary primer PCR,AP-PCR),RAPD,建立在,PCR,基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链,(,通常为十聚体,),为引物，对所研究基因组,DNA,进行,PCR,扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经,EB,染色来检测扩增,DNA,片段多态性。可用于进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。,六,、,差异显示,RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT-PCR),DDRT-PCR,技术最大的优点是省去了,cDNA,克隆和随后繁杂的克隆筛选工作。但此方法也存在需要合成的引物多、费用大、操作技术要求高、虚假特异区带出现较多等缺点，仍有待进一步完善。如图,8-4,。,七、单链构象多态性,PCR(single strand construction polymor-phism PCR,SSCP-PCR),其原理是单链,DNA,分子因单一核苷酸不同，其二级结构有所差异，,PCR,产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同。通过比较,DNA,的电泳类型，即可测出突变。其优点是所需样品,DNA,量极少，灵敏度高，可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选多个样品。,八、多重,PCR(multiplex PCR),多重,PCR,是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的,DNA,片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段,PCR,扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常,(,图,8-5),。多重,PCR,具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与,Southern,杂交结果同样可靠，且多重,PCR,尚可检测小片段缺失。,PCR,技术在医学中的应用,遗传性疾病的诊断,病原微生物的诊断,癌症的诊断,移植组织配型,其他疾病的诊断,疾病的疗效观察及病情监测,一、遗传病相关基因的检测,如图,8-8,所示。,如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关，突变会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限制性内切酶消化,PCR,产物，通过电泳酶切图谱就能直接判断碱基发生突变与否。若某一遗传病与这一酶切位点的存在或消失有连锁关系，,PCR-RFLP,即可用于该遗传病的诊断。,苯丙酮尿症,:(,缺苯丙氨酸羟化酶,),不能使苯丙氨酸酪氨酸，智力发育不全，对,13,个外显子,PCR,产物酶切鉴定基因突变。,地中海贫血：,-,珠蛋白（四聚体）,PCR,产物正常为,136bp+110bp,，异常（缺失）仅有,110bp,。,镰刀状红细胞贫血,:,因,-,珠蛋白基因第六位,GAA(G),（为,Oxa,酶切点）,GTA(G)(A T),，正常为,294bp 191+103bp,，异常为,294bp,（纯合子或）杂合子,103bp+191bp+294bp,杜氏营养不良症：对六个外显子,PCR,产物有缺失条带产生（男胎诊断）,血友病：,F,因子基因,PCR,产物为,142bp,，,bcl-I,酶切正常为,99bp+43bp,，异常（点突变）只有,142bp,（男胎诊断）。,二,.,病源微生物的检测,病毒,:,如,:HIV,肝炎类病毒,HPV,SARS,细菌,:,碳疽,其他微生物,:,沙眼衣原体,梅毒螺旋体,肺炎支原体,寄生虫,:,弓形虫,疟原虫,三、肿瘤的诊断和研究（原癌抑癌基因）,癌基因、抑癌基因的检测,基因的缺失、点突变是原癌基因激活、抑癌基因失活的方式之一。以往较大的基因缺失在显微镜下分析，微小的缺失多用印迹杂交技术，目前用,PCR,技术甚为简便。,原癌基因异常激活,RT-PCR,测,mRNA,表达量,血液病的融合基因（,bcr-abl,）全长,mRNA,的,RT-PCR,产物阳性,点突变,PCR,产物酶切后电泳检测。,抑癌基因缺失：有缺失时,PCR,产物减少，完全缺失时无,PCR,条带。,肿瘤相关病毒基因：原发肝癌（,HBsAg,),若对,HBV,基因,PCR,阳性，证明二者相关。,四,.,组织配型,方法,:,免疫学 分子生物学：,PCR SSCP RFLP,基因芯片,I,类,(A,B,C),与疾病发生频率有关,II,类,(DR,DQ,DP),等 移植配型,五、疾病的疗效观察及病情监测,如：,HBV,，,HCV,，,HIV,白血病细胞残留,PCR,技术在法医学上的应用,PCR,技术在法医学中的应用是检测人类白细胞抗原,-DQ,位点的分型，另外，,Y,染色体特异,DNA(DYZ,1,、,DYZ,3,)SRY,基因的,PCR,分析使性别鉴定成为常规。,在,Y,染色体上只要缺失,SRY,，个体就发育成为女性。,用针对,SRY,基因和,X,、,Y,同源序列的两对引物进行,PCR,扩增，只有男性出现,299bp,的扩增片段。用这种方法鉴别胎儿、运动员、犯罪人员等的性别，准确率极高。,STR,检测 做个人身份鉴定,16-18,个位点,PCR,扩增产物的检测分析,琼脂糖凝胶电泳法,聚丙稀酰胺凝胶电泳法,PCR-ELISA,检测,荧光探针检测,电泳法,PCR,系列试剂盒操作过程,样品处理（,DNA RNA,）,热启动,PCR,扩增普通引物,扩增产物电泳分析结果,PCR,酶免检测试剂盒原理,PCR,核酸扩增技术,核酸杂交技术,抗污染技术,酶联技术,化学显色技术,PCR-ELISA,系列试剂盒操作过程图解,PCR,ELISA,法定量,PCR-,酶免,(ELISA),检测法特点,应用了,UNG,防污染功能,由于引入探针杂交，特异性提高。,酶链反应的放大效应使本法的灵敏度更高；,本法对仪器设备要求不高，无需特殊仪器即可开展，易于普及,。,PCR-ELISA,系列试剂盒操作过程,样品处理（,DNA RNA,）,抗污染反应,热启动,PCR,扩增带标记引物,扩增产物检测,产物变性,与特异性探针杂交,酶联反应,显色反应,EIA,、,PCR,、,PCR-ELISA,的比较,PCR,荧光检测法,荧光染料法：,SYBR Green,TaqMan,法,Molecular Beacon,法,Roch,Amplifluor,双链探针,SYBR Green,工作原理,Cycle 1,Cycle 3,Cycle 2,通过,Tm,值来确定产物,SYBR Green,特点,使用方便：不必设计复杂的引物,没有序列特异性：可以用于不同的体系,便宜,灵敏,缺点：与非特异性产物结合,荧光,PCR,原理图,(TaqMan,法,),TaqMan,法特点,优点：,对目标序列具有很高的特异性,与,Molecular Beacon,相比设计相对简单,缺点,价格较高,只适合有一个特定的目标,不能进行熔解曲线分析,Molecular Beacon,法原理,Molecular Beacon,法原理,Molecular Beacon,法原理,Molecular Beacon,法原理,Molecular Beacon,法的特点,优点,对目标序列有很高的特异性（检测,SNP,）,荧光背景低,缺点,设计困难，价格较高,只能用于一个特定目标,无终点分析功能,Roch,杂交探针原理图,Amplifluor,原理图,双链探针原理图,实时荧光定量,PCR,检测方法,单色：,PE5700,、,iCycler,多色：,PE7700,、,iCycler,、,LightCycler,等,实时荧光定量,PCR,检测方法,仪器（,ABI PRISM,7900HT,）,实时荧光定量,PCR,原理,Ct,值（,C,代表,Cycle,，,t,代表,threshold,）含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时经历的循环数。,荧光域值（,threshold,）的设定：,10,SD,cycle,6-15,荧光定量标准曲线,相对定量,核酸扩增技术与基因定量,PCR,ELISA,法,以,Roche,试剂为代表通过加入,QS,对待测物进 行含量测定,PCR-,荧光法,利用四个定量标准品,终点检测不能定量,PCR,实验室的建立,为了对一个特定序列进行重复,PCR,检测，需要三个不同的区域，以保证对所感兴趣的目的序列进行可靠的，不污染的,PCR,。,试剂准备区,样本准备区,扩增区,检测区,什么样的临床基因扩增检验实验室是最标准的？,临床基因扩增实验室设置的一般原则,各区独立,注意风向,因地制宜,方便工作,“,十六字口诀,”,PCR,实验室的建立(,试剂准备区,),试剂准备区里一般储备有,PCR,实验所需的所有试剂,在试剂准备区进行,PCR,反应主混合物的配制。,将大体积的主反应混合物分装后包存，即方便使用，又可以避免反复从同一试剂管中吸取试剂带来的可能污染。,一个比较合理的实验安排应该是：先将主反应混合物从冰箱取出按照当天实验所需将住反应混合物分装到反应管中，放,4,冰箱暂时贮存，然后进行样品处理。,PCR,实验室的建立(,样本准备区,),样本准备区专门用作样品的制备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取如下预防措施,以前,PCR,扩增产物和带有要扩增序列的,DNA,克隆不能在该房间操作。,组织培养物，组织标本，待测血清等各类标本均应在样品处理间根据需要进行,DNA,或,RNA,处理。,样品处理区进行样品处理的所有仪器设备要专用，不能用于其他区域。,DNA,样品应用有专门防护的移液器操作，以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。,PCR,实验室的建立(,样本准备区,),离心管打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生，而且管子不能用力崩开，否则会产生气溶胶。,任何时候都应穿戴实验服，戴手套，手套要经常更换，尤其在抽提过程中每一步都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。,每次处理完样品后要及时清理干净，将不需要的标本装垃圾袋灭菌处理，需要暂时保存的标本分装放,-20,。,样品处理区要经常用稀释溶液（漂白粉、过氧乙酸等）及时擦拭桌面、拖地及紫外灯消毒,PCR,实验室的建立(,扩增区,),在样品处理区处理好的待测标本拿到扩增区进行加样准备,PCR,扩增。,作为规则每次实验都应该有一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析制备,PCR,前过程的效率和洁净程序。一个弱阳性对照样品对于验证,PCR,反应中是否含抑制物及扩增效率非常有效。,阴性对照要与每组样品同时做，以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在,PCR,产物的污染，阴性对照反应管中应该包括除核酸以外的所有试剂。,PCR,实验室的建立(,扩增区,),PCR,反应中使用阳性对照应考虑到：,a.,为了作为一个有效的对照，反应中只应该含有有限拷贝数的靶序列（,10-10,4,）；,b.,通过减少,DNA,的量可以减少,DNA,气溶胶污染其他样品的机会。,扩增区的仪器、设备、实验服专用。,扩增区使用的反应离心管、,tip,吸头经高压灭菌消毒后用于检测区的实验。,PCR,实验室的建立,(,检测区,),检测区,是一个专门用于对,PCR,结束后的样品进行分析及数据处理的区域，,检测区,中使用的所有试剂、一次性器材和仪器都必须是专门用于这一目的，绝不能将该区域的试剂或仪器用于任何上述三个区域的活动。,PCR,实验室所遇到的主要污染源是前一次,PCR,过程的产物，这产生于吸取和操作,PCR,样品时所产生的气溶胶。如果,PCR,产物只限于在,检测区,操作，这些气溶胶不会产生问题，但如果它们被手套，移液管，研究者或实验服带到了前,PCR,区就会引起污染，因此，在,检测区,，用于分析的工具应该是专用的。,进行,PCR,操作实验，实验的交通方向应该是单方向，应遵循从,“,净区,”,到,“,脏区,”,的原则,使用,PCR,检测试剂的操作规范,要有足够的空间用于,PCR,检验,-,实验必须分区,必须的实验仪器、设备必须齐全，不能简单凑合替代,PCR,仪加样器（套数）振荡混合器手套枪头,枪头盒工作服（件数）电泳仪电泳槽,紫外灯酶标仪,PCR,实验人员要经过专门培训,实验室，实验室移液器要随时清理，擦拭，实验用过的离心管，枪头要浸泡在酸性溶液里，防止干燥。,实验用离心管，枪头灭菌后方可使用。,实验用的,PCR,仪要经常校正一下温度,实验开始前先仔细阅读说明书，理解每一操作步骤的目的。,严格进行样品的采集、保存及处理,PCR,反应的污染防治,(,PCR,的放大倍数和每个,PCR,循环的平均效率),