乙肝病毒DNA的实验室检测医学课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,LOREM IPSUM DOLOR,乙肝病毒,DNA,的实验室检测,袁立云,1,、荧光定量,PCR,技术,2,、乙肝病毒的感染,3,、,HBV-DNA,与临床,荧光定量,PCR,技术,荧光定量,PCR,技术,Polymerase chain reaction(PCR,),，聚合酶链式反应，是一种,DNA,的快速扩增技术。,PCR,技术通过两个短的称为引物的,DNA,小片段和一种耐热酶（,TaqDNA,聚合酶）的作用，经过,高温变性、低温退火、适温延伸,三个步骤,在,3,个小时内,反复循环,25-30,次，把特定的,DNA,片段扩增,1000,万倍。,每个,PCR,体系含,4,种主要成分：,含有待扩增序列的,DNA,模板、引物、,TaqDNA,聚合酶、脱氧核糖核酸三磷酸（,dNTP,）,实时荧光定量,PCR,技术，是指在反应体系中加入,荧光标记,，利用荧光信号积累实时检测整个,PCR,过程，通过,标准曲线,对,PCR,终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。,荧光定量,PCR,技术,PCR,反应过程,5,5,3,3,d,.,NTPs,Taq,酶,Primers,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,反应组分,变,性,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,延 伸,5,3,5,3,5,3,5,3,3,5,3,Taq,Taq,5,5,重 复,退 火,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,3,3,5,3,5,3,循环,2,4,个拷贝,循环,3,8,个拷贝,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,5,3,荧光定量,PCR,原理,插入染料法,SYBR Green I,杂交探针法,(,最常用,),TaqMan,TaqMan,探针,5,5,3,3,d,.,NTPs,Taq,酶,Primers,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,反应体系,变 性,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,Taq,l,5,3,R,Q,Probe,5,3,R,Q,5,3,5,3,5,3,R,Q,退 火,5,3,1.,链取代,Taq,3,Q,R,5,5,3,3,Q,Taq,R,5,2.,水 解,3.,聚 合,5,3,Q,Taq,R,3,5,4.,检测荧光,5,3,3,Q,Taq,R,5,l,乙肝病毒的感染,乙肝病毒的感染,（一）乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg,：,是,HBV,感染的主要标志,HBsAb,：,保护性抗体,HBcAg,：,仅存于感染的肝细胞核内，,一般不存在于血循环中,HBcAb,:,非保护性抗体，,HBcAb-IgM,提示,HBV,处于复制状态,HBeAg,：,HBV,复制及强感染性的指标,HBeAb,：,有一定的保护作用，预后良好,乙肝病毒的感染,（二）,HBV-DNA,与“两对半”,1.“,两对半”：机体的免疫反应状态；,2.“,携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标,不能 反应体内病毒复制水平与感染程度,。,FQ-PCR,：检测的是,HBV,本身的遗传物质,DNA,，是,病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,HBsAg,(,),HBV-DNA(,),HBeAg,(,),HBV-DNA(,),3.,血清学指标,(,),不能排除,HBV,感染,。,乙肝病毒的感染,5.HBeAg,阳性标本,HBV DNA,检出率,90,左右,HBeAg,与,HBV DNA,有着良好的相关性,4.,也可能出现,HBsAg,(,),，,HBV-DNA(,),。,乙肝病毒的感染,HBV DNA,HBV DNA,贯穿感染者的终生，是评价病毒复制的金标准,ALT,正常,增高或者波动,正常,增高或者波动,免疫耐受期,免疫清除期,非活动或低（非）复制期,再活动期,肝组织学,无明显异常,或轻度炎症纤维化,中度或严重炎症、纤维化快速进展,无炎症或仅有轻度炎症,中度或严重炎症、肝纤维化,临床诊断,慢性,HBV,携带者,HBeAg,阳性慢性乙型肝炎,乙型肝炎肝硬化,非活动性,HBsAg,携带者,HBeAg,阴性,慢性乙型肝炎,乙型肝炎肝硬化,乙肝病毒的感染,慢性,HBV,感染分期及相关实验室检测指标,鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展,2009,HBV-DNA,与临床,HBV DNA,检测的临床意义,HBV DNA,是,HBV,存在最直接的依据,HBV DNA,是,HBV,复制的标志,HBV DNA,是患者具有传染性的标志,HBV DNA,对乙肝两对半起补充作用,HBV DNA,是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标,HBV DNA,可检测出隐匿性慢性乙型肝炎,PCR,检测,“,窗口期,”,核酸检测缩短的,“,窗口期,”,的天数,HBV,56,6-15,HCV,70,41-60,HIV,22,10-15,有利于献血员窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断,提供直接证据缩短,“,窗口期,”,HBV DNA,检测的临床意义,调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于,HBV,复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人,HBV,都无复制。因此，要准确知道,HBV,是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测,HBV DNA,来决定。,HBV DNA,检测的临床意义,HBV DNA,检测的临床意义,HBsAg,和,HBeAg,均阳性而,HBV DNA,阴性？,干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。,PCR,所用引物相应的,DNA,序列发生突变，此引物与突变,DNA,不能配对结合。,病毒,DNA,整合于宿主肝细胞染色体而血中游离,HBV DNA,很少或缺乏。,目前尚无一种能迅速、直接杀死清除乙肝病毒的药物，最好的抗病毒药物疗效也仅能达到,50,左右。,目前国际医学界公认的治疗慢性乙肝有确切疗效的抗病毒药物主要有两大类：,干扰素,：重组人,-1b,干扰素、,-2a,、,-2b,干扰素等。,核苷类似物,：拉米夫定、阿德福韦。,乙肝的治疗,主要包括,抗病毒,、免疫调节、抗炎保肝、抗纤维化等,对于,HBV DNA,10,5,的患者应进行抗病毒治疗,乙肝的治疗,谢 谢,