基因克隆表达.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因的克隆与表达,基因克隆,(,gene cloning),基因表达,(,gene expression),-,原核基因表达,-,真核基因表达,基 因 克 隆,Gene Cloning,概述,克隆载体,受体细胞,体外重组的策略,基因克隆工作流程,一、概述,确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质,揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理,提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码,1973年Cohen完成第一个基因工程实验,经,体外重组,获得杂合DNA,杂合子转化入大肠杆菌,所需元件：,限制性内切酶,连接酶,载体,受体细胞,基因克隆的技术路线,目的基因 载体,体外重组,重组子（杂合DNA）,转化,受体细胞,筛选阳性克隆,大量扩增，获得子代DNA,二、克隆载体,复制基因,(,replicator,),选择性记号,克隆位点,三、受体细胞,1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。,2、要求：易于接纳外源DNA,无特异的内源性核酸内切酶,载体复制、扩增不受阻,与载体有互补性,四、体外重组的策略,1、粘末端连接,1）全同源粘末端连接,最方便简单,高背景,-,载体自身环化,双向插入,2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略,粘,-,粘连接：最有效、最快捷,粘,-,平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平,2、平末端连接：,酶切点为平末端或任何两个末端补平的,DNA,效率低，酶用量大,3、人工接头连接,人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段,4、T-A克隆,T-vector,两条链的,5,端含有一个游离的,T,PCR,过程中，普通的,Taq,酶可在产物的,3,端多加一个,A,五、基因克隆的工作流程,（一）目的基因的获得,1、直接分离,3、构建cDNA文库,4、PCR,5、人工合成,6、差异显示,1、直接分离DNA适用于克隆原核生物的基因组文库,2、构建基因组文库，筛选目的基因,基因组文库,(,gene library),：,将某种生物的基因组,DNA,切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组,DNA,片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备DNA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）,特点及应用：,包含所有遗传信息,构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）,筛选难度大,用于研究基因在基因组中的情况,3、构建cDNA文库，筛选目的基因,cDNA,文库,(,complementary DNA library),以组织细胞中的,mRNA,为模板，反转录合成双链,cDNA,，各,cDNA,分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的,cDNA,的集合即,cDNA,文库。,cDNA,文库仅包含正在表达的基因,不同物种、不同组织的,cDNA,文库不相同,基因总量少，易筛选,4、PCR扩增目的基因片段,适用于克隆序列清楚的基因,以基因组,DNA,为模板，直接进行,PCR,扩增较难,多采用以,mRNA,为模板的,RT-PCR,法,5、人工合成较短的DNA,6、差异显示法(differential display,DD)筛选差异表达的基因,（二）体外重组,连接体系的建立：,温度：粘末端连接：,12-18,平末端连接：室温（低于,30),DNA,量：载体分子数,/,目的基因分子数,=1,：,1-3,酶量：平端连接时需加大酶量,（三）转化Cacl,2,法、电击法,（四）重组子的筛选及鉴定,1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）,原位杂交,2、鉴定：,长度鉴定：酶切、,PCR,方向鉴定：联合酶切,测序,基因的表达,Gene Expression,一表达系统：,基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。,据受体细胞的不同可分为：,1,原核表达系统,：,将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。,2,真核表达系统,：使外源基因在真核细胞中表达的体系。,二原核生物基因结构和表达特点,原核生物染色体,DNA,是裸露的环形,DNA,，,其转录和翻译是偶联的连续进行。,原核生物形成,多顺反子,mRNA,：,mRNA,在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。,3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统,4、,原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成,操纵子,。,操纵子（operon）,：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位,原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。,共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。,包括：调控区,(,调节基因，启动基因，操作基因,),、,结构基因,5、原核生物中参与转录的基因结构：,启动子,终止子,启动子(promoter,P,),是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,一般长,40-60,bp,，,富含,A-T,碱基对,具有保守序列：,-10,区（,pribnow,box,）：,TATAAT,-35,区：,RNA,聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录,各种启动子启动转录能力不同。,启动子强弱取决于,-35,区和,-10,区的碱基组成及其间隔序列,终止子（terminator，,T,）,:位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列,6、,与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点,转译起始密码子AUG,或GUG,SD顺序,（shine-dalgarno）：,AUG,上游,3-11,bp,长约,3-9,bp,mRNA,与,16,s,核糖体亚基间的识别与结合序列,三外源基因在原核表达系统中表达的必要条件,：,删除内含子和,5,非编码区,外源基因置于强启动子和,SD,顺序控制下,维持正确开放阅读框架（,ORF,）,mRNA,稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解,四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素,：,1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。,常见原核强启动子,：,Plac,：受,Lac,阻遏蛋白负调，受,IPTG,的诱导,Ptrp,：,取自大肠杆菌色氨酸操纵子。,Ptac,:,Lac,启动子和,Trp,启动子的杂合启动子。,P,L,和,P,R,启动子,：噬菌体早期左,/,右向启动子，受,噬菌体,CI,基因负调控。温度诱导。,2、基因剂量：,3、核糖体结合位点：,SD,顺序与,16,srRNA3,末端互补程度。,AUG,SD,间距离。,AUG,后的核苷酸,五原核表达载体：,适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。,主要元件：强启动子,SD,顺序,筛选标志,其它调控基因,类型：,融合型表达载体：,-,融合蛋白,非融合型表达载体：,-,天然完整蛋白,分泌型表达载体：,-,产物可跨膜分泌至胞周间隙,（一）融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,融合型表达载体,融合基因,技术关键,：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架,。,选择合适酶切位点,加人工合成的,DNA,接头,构建位相载体,-,-ATG-AAC CTG,GAA TTC,CTA GGT-,-TAC-TTG GAC CTT AAG GAT CCA-,EcoRI,BamHI,AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT,TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA,载体部分序列,DNA序列,位相载体-含有3种读码框的系列载体,优点：,表达效率高,产物稳定,易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定,易纯化：利用融合原核多肽的特性,Ptac：IPTG诱导,GST融合蛋白直接纯化,产物切割方便：,pGEX-1,T凝血酶,pGEX-2T-凝血酶,pGEX-3T-X因子,位相载体,融合型载体-pGEX系列,（二）非融合型表达载体,P,SD,Foreign DNA,非融合型表达载体,非融合基因,主要元件：强启动子,SD,：,ATG,：第一个密码子,非融合型表达载体-pPL-Lamda,P,L,启动子-温度诱导,插入位点-HpaI,（三）分泌型表达载体：,1、主要元件：,启动子和SD序列,信号肽序列,：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜,2、优点：分泌表达，避免降解。,分泌型表达载体-pINIII-ompA1,分泌型融合表达载体-pEZZ18,六提高表达水平的手段,1、选择合适载体，提高翻译水平,强启动子,-,提高转录水平,核糖体结合位点（,ATG-SD,）,避免产物降解：分泌,/,融合表达,细菌蛋白酶抑制剂,2、选择合适宿主,Lac 启动子-LacI菌,P,L,/P,R -,CI,857,溶源菌,3、诱导表达,温度诱导-,P,L,P,R,/,IPTG的化学诱导-Plac、Ptac,4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解,七表达产物的检测：,1、特异性鉴定：,荧光抗体法,免疫沉淀法,免疫印迹法,ELISA,2,、,生物学活性鉴定,八、原核表达系统的缺点,1、没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子,2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工,真核表达系统的必要性及优势,1.,具转录后加工系统,2.,具翻译后修饰系统,3.,可实现真正的分泌表达,4.基因治疗,真核基因结构及表达调控特点,（一）真核基因组的复杂性,真核基因组庞大，,具大量非编码序列,-,mRNA,丰度不同,结构复杂,：染色质、核膜、线粒体,-,表达调控多样,不连续性：内含子、外显子,没有操纵子结构,(二）真核表达系统,组成：真核表达载体,受体细胞,基因转移方式,据受体细胞及表达载体的不同分为3种：,酵母表达系统,哺乳动物细胞表达系统,昆虫细胞表达系统,（三）转化,1、原生质体法：去除厚壁,2、电穿孔法：效率较高,（四）外源基因的表达,1、胞内表达,2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列,（五）缺点,不能实现全部的翻译后修饰功能,