SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量.doc

实验六报告：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用1 。通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电荷量约为蛋白质本身静电荷10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴在18的数量级，保持恒定，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。因此SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响。 综上，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。 3.仪器与试剂 3.1仪器设备 DYY-2稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、100l微量进样器（上海医用激光仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；3.2主要实验器皿 烧杯（50ml3）、大培养皿一套、100ml量筒、玻璃漏斗；3.3实验材料 实验四麦清蛋白脱盐样品；3.4实验试剂 实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、异丙醇溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰乙酸； 试剂的配制： 分离胶贮备液：称取Tris18.17克，SDS0.4克，溶于水，用3NHCl调pH到8.8，水定至100毫升，其中Tris为1.5M，SDS为0.4%。 浓缩胶贮备液：称取Tris6.06克，SDS0.4克，溶于水，用3NHCl调pH到6.8，水定容至100毫升，其中Tris为0.5M，SDS为0.4%。 Acr/Bis储备液：称Acr30克，Bis0.8克，加蒸馏水到毫升。10%过硫酸铵：过硫酸铵1克，加蒸馏水至10毫升，用时现配。TEMED：冰箱保存。 Tris-HCl样品缓冲液（pH8.0）：称Tris6.05克，甘油50毫升，巯基乙醇25毫升，溴酚蓝0.5克，SDS10克，溶于水，用HCl调pH为8.0，水定容至500毫升。电极缓冲液：称取Tris3.03克，甘氨酸14.41克，SDS1.0克，溶于水，定容至1000毫升。 4.操作步骤 4.1电泳槽的安装 玻璃板要先用洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，洗净的玻璃板装入硅胶夹套中，垂直的固定在两槽中间。在固定时，要四个螺旋对角线拧紧。电泳槽装好后，用溶化的电极缓冲液配配制的2%的琼脂注入高玻板一侧电泳槽的下方，从而封堵形成夹胶室，以防漏胶，备下一步应用。4.2制胶 分离胶的配制（T%=12.5%）试剂名称：分离胶缓冲液 Acr/Bis储备液dH2OTEMED过硫（AP）用量(ml) 2.7 4.5 3.7 0.005 0.2 混匀，沿高玻璃板中央定点灌胶至距离矮玻璃板2-2.5厘米处，放正，立即沉稳轻缓封水层，静置聚合；聚合后倒去水层，以滤纸条吸干残余水层，灌注浓缩胶。浓缩胶制备:试剂名称浓缩胶缓冲液Acr/Bis储备液dH2OTEMED过硫酸铵（AP）用量(ml) 1.25 0.75 3.0 0.005 0.020 浓缩胶灌至与矮玻璃板顶端相齐，立即插入梳子，静置聚合。浓缩胶聚合后，灌注电极缓冲液，再拔出梳子，准备上样。4.3样品的处理 Marker：市售标准样品按要求制备 待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获得的峰值管制备的SDS-PAGE样品所有样品于沸水浴中加热5分钟，冷却后上样。上样量：marker20ul，待测样品：4ul、10ul、20ul、30ul、50ul。4.4电泳 样品加入后，准备电泳，本次实验：取稳流状态，浓缩胶15mA，分离胶25mA。本次试验的溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢！4.5检测（1）染色液：0.4%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%乙酸（2）脱色液：20%甲醇，7%乙酸 （3）步骤电泳后，取出胶板，先在自来水中浸泡10min，以浸出部分SDS，（加热2h应该在通风橱中操作），然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。4.6测量蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量 用卡尺或坐标精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移的距离定位d2，根据下面的公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm=d2/d1以标准蛋白的迁移率为横坐标，以其对应的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线。然后根据未知样品的迁移率，在半对数坐标图上查出其对应的分子量。并由所得结果分析实验四麦清蛋白的初步提取的实验的效果及后续进一步纯化的方案。 5.数据整理 溴酚蓝迁移距离d1=10.10cm 表1 Marker的迁移距离 Marker 1 2 3 4 5 6 7 d2 1.00 2.05 3.004.60 6.30 8.05 8.95 MW(KDa) 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 表2 部分麦清蛋白的迁移距离 麦清蛋白 1 2 3 4 5 d2 2.10 2.40 2.50（目标蛋白）3.6 3.7 6.结果计算与讨论及分析 表3 Marker的迁移率及对数分子量 Marker 1 2 3 4 5 6 7 迁移率Rm 0.099 0.203 0.297 0.455 0.624 0.797 0.886 对数分子量 2.064 1.821 1.653 1.544 1.398 1.265 1.158 图1 Marker的标准曲线 结果计算：目标蛋白的迁移率Rm=0.248，代入标准曲线的公式中得到：MW(目标蛋白)=62.78 KDa。麦清蛋白的分子量为相对分子质量为60kDa左右，结果相近，说明实验结果是可信的。 讨论及分析：在电泳图谱中，Marker有6条清楚的谱带，第7条位于蛋白前沿，迁移不充分。在绘制标准曲线的时候，发现不忽略Marker1，R2为0.9583，忽略Marker1，R2为0.9869。忽略后的拟合程度更好，不知道本次实验中是否可忽略Marker1。样品采取梯度上样是为了使含量高的蛋白低上样量，含量低的蛋白高上样量，使谱带更加清晰。目标蛋白含量较高，说明该蛋白在小麦种子休眠中起重要作用。根据电泳谱带信息，可见能够分析的谱带有10条，本次实验一共分离得到10种蛋白，其中带较粗含量较高的有三种蛋白，说明在小麦种子休眠过程中起着重要作用。 若要对目标蛋白进行分离纯化，可以根据目标蛋白与杂蛋白的分子量差异，分子量大小排在什么位置，进行试验设计，再上样进行一次层析。由于目标蛋白的上一条谱带迁移距离为2.4cm，与其2.5cm非常接近，层析中可以通过控制洗脱液流速，最终实现分离。 7.结论与展望 本实验以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定麦清蛋白分子量，通过目标条带相对迁移率与Marker蛋白质标准曲线的比对，计算得到目标蛋白分子量大小。实验结果从数值上而言与标准值相近，可见以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量准确度相当可观。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离样品，结果易于鉴定、比较、分析和计算，广泛应用于未知蛋白质分子量的测定，但其易受环境和人为等诸多因素的影响，有待进一步的改进和完善。 8.思考题与质疑 对照比较一下活性电泳与本次变性电泳中各自的电极缓冲液的成分和离子浓度，是否相同？相关设计的可能原因会是什么？ 答：不相同，比较如下： pH Tris(g) 甘氨酸(g) SDS(g) 体系(ml) 活性电泳 8.3 6 28.8 10000 变性电泳 8.3 3.03 14.41 1.0 1000 离子浓度加大是因为在SDS-PAGE中要使蛋白质与SDS结合生成SDS-蛋白质复合物，从而使蛋白质带上强负电，因此必须在整个电泳缓冲体系中加入高浓度的SDS及保持高离子强度环境，可以适当增大电流，使电泳速度提高。甘氨酸量增多是因为甘氨酸在浓缩胶中作为尾随离子，追赶前导离子，将蛋白压缩聚集成一条狭窄的区带；蛋白质结合上SDS后，分子量变大，增多甘氨酸可以使浓缩效应加强。 连续做了两次电泳，所用仪器设备和试剂等完全相同，不同的只是电泳类型和动手操作，但电泳图谱的效果却差异很大，SDS-PAGE的图谱明显更加清晰稳定，请分析其主要原因。给我们什么启发？ 答：上一次实验是活性电泳，需要保证蛋白质的活性，而活性易受各种环境因素影响，且在电泳过程中蛋白质可能发生降解、变性，导致拖尾现象严重，蛋白质的分离效果与蛋白质的分子量、分子形状以及带电量相关；本次实验为变性电泳，由于SDS的结合，将蛋白质本身带电量和形状的影响因素排除，唯一影响因素为蛋白质间分子质量差异，进一步提高了泳带的区分度和集中度，更清晰稳定，并使电泳结果可以量化。 启发：为了获得更好的实验结果，有时候需要建立在单一变量的原则上；一项技术的发展往往是多学科交叉的结果，变性电泳引入了阴离子去污剂SDS，取得了很好的效果。