应用微生物学.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,应用微生物学,Applied Microbiology,应用微生物学,概论,微生物的生长,微生物的代谢,微生物的遗传与遗传育种,微生物基因工程,应用微生物的基因操作系统,酶工程与生物转化,微生物发酵,微生物代谢工程,概 论,基本概念,应用微生物学的发展,微生物细胞的结构,重要的应用微生物,定义,应用微生物学:,以一定的直接或间接应用目标研究微生物及其相互作用和与环境的作用的科学。,(applied microbiology),微生物学与相关的生物技术相结合，以实现一定的,直接或间接应用目标。,(microbiology in application),微生物的特点,资源量大（多样性丰富）,生物量大（生长迅速）,可塑性大（便于操作）,个体小（便于运输、携带）,完成自然界的物质循环,造福人类,引起灾难,当前人类面临的问题,资源的压力,环境的挑战,传染病的新生与复发,应用微生物学研究的一般流程,提出问题（工业、农业、环境、健康、国防,）,微生物？,No,Yes,菌种 解决问题,发酵 解决问题,应用 解决问题,应用微生物学的发展,微生物学的发展是与应用紧密联系的,逐步建立方法认识微生物,Leenwenhock(1673),显微镜,Jenner(1798),牛痘,Basteur(1860s),发酵、低温灭菌、自然发生,Koch,(1881),纯培养,微生物形成产业,Fleming(1929),青霉素,Waksman(1944),链霉素,现代生物技术,Cohen(1972),DNA 重组,微生物细胞的结构,细胞壁,形态保持、物质交换、信号识别,细胞膜,转运,细胞质,酶、反应场所,细胞核,遗传物质,核外遗传物质,线粒体、质粒,重要的应用微生物,病毒：,-,噬菌体,细菌：大肠杆菌,(,E.coli,),棒杆菌,(,Corynebacterium,),放线菌：链霉菌,(,Streptomyces,),酵母菌：酿酒酵母,(,Saccharomyces cerevisia,),真菌：曲霉,(,Aspergillus,),第一章 微生物的生长,微生物生长的条件,培养基,生长动力学,微生物细胞的化学组成,细胞中几种主要元素的含量,(干重的百分数),细胞干物质中主要组分和含量(%),元素,细菌,酵母菌,霉菌,C,5053,4550,4063,N,1215,7.512.4,710,O,20,30,40,H,8,7,7,细菌,酵母菌,霉菌,蛋白质,5080,3275,2040,碳水化合物,1228,2763,710,脂类,520,215,440,核酸,1020,68,1,灰分物质,210,710,510,微生物生长的条件物质条件,水,aw=P/P,0,微生物类群,最低aw值,细菌,0.91,酵母菌,0.88,霉菌,0.80,耐干霉菌,0.65,耐高渗酵母菌,0.60,微生物生长的条件物质条件,碳源和氮源,O H P S K Ca Mg Fe,Mn Cu Zn Mo Co Ni V B Cl Na Si,维生素、氨基酸等,微生物生长的条件环境条件,pH,中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱,温度,最适、生长、耐受,氧气,严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧,压力,渗透压,极端环境微生物(extremophile),不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured),极端微生物与不可培养微生物,极端环境微生物(extremophile):依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物,嗜热菌：50-80,C (hyperthermophiles80C),嗜冷菌：,16C,嗜酸菌：,9,嗜盐菌：,3M,嗜压菌,不可培养微生物(VBNC vive but non-cultured),培养基,提供微生物生长所需物质与环境条件的体系,培养基的组成要素,碳源、氮源、提供各种元素的无机盐,生长因子或含生长因子的物质,水、固化基（固体培养基）,pH,、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件,培养基的种类,按物理状态：固体、液体、半固体,按化学组成：合成、丰富、半合成,按使用目的：种子、发酵、筛选、再 生、富集,培养基的选择和设计原则,适用：利于达到目的,利于下游工艺,重复性好,经济：原料价格,原料用量,全工艺综合平衡,安全：环境影响,生物安全,培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容,生长动力学,增值曲线,（,Multiplication curve,）：,细胞数-时间,生长曲线,（,growth curve,）：,细胞量-时间,微生物生长的实验计量,显微计数,菌落计数,浊度测定,细胞干重,微生物生长的数学描述,比生长速度,(specific growth rate),=dx/xdt,细菌 0.6-1.2,酵母菌 0.3-0.5,放线菌 0.1-0.3,真菌 0.1-0.3,生物量倍增时间,(biomass doubling time),t,d,=ln2/,增值度,(multiplication degree),x/x,o,第二章 微生物的代谢,微生物初级代谢,微生物次级代谢,代谢调节,微生物的代谢,微生物细胞所进行的生化反应的总和,物质代谢,细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程,能量代谢,载体,信息代谢,微生物初级代谢,微生物从环境摄取物质、获得能量、合成自身新物质的过程,营养物 废弃物,能量（用于生长）,能量,合成代谢,（用于运动和物质转运）,细胞组分 酶,分解代谢,能量来源,重要的初级代谢途径,糖酵解途径,糖代谢的共同分解途径,三羧酸循环,将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量,磷酸戊糖途径,产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物,ED途径,细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径,氨基酸合成途径,糖酵解途径,(Embden-Meyerhof pathway),GLC,HXK,ZWF SOL GND,G6P,G15L P6G RU5P,PGI,F6P,PFK,FBP,F16P,FBA,GLYG3P,DHAP,GAP,TPI,TDH,P13G,PGK,3PG,GPM,2PG,ENO,PEP,PYK,PDC ADH,PYR,ACA ETH,三羧酸循环,(Krebs cycle),PYR ACoA,MDH,CIT,MAL,OAA CTT,FUM,ACO,FUM ICI,SDH,OSM,IDP,SUC,SUCC AKG,LSC KGD,磷酸戊糖途径,氧化（,产生,NADPH,）,RU5P,P6G,G15L,G6P,RKI,RPE,非氧化,R5P X5P,（,分子重排,）,TKL TKL,GAP,S7P,E4P,TKL,F6P,ED途径,存在于某些缺乏完整,EMP,途径的微生物中，是微生物特有的,将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。,氨基酸合成途径,GLC 3PG ,Ser,Gly,Met,（3,磷酸甘油酸衍生型）,PPP ,R5P PEP ,Phe,Try,Trp,（,芳香族,氨基酸）,His,PRY ,Ala,Val,Leu,（,丙酮酸衍生型）,OAA ,Asp,ASA ,Lys,（,草酰乙酸衍生型）,TCA,Asn,HS ,Thr,AKG,Met Ile,Arg,Glu,Gln,（,酮戊二酸衍生型）,Pro,微生物次级代谢,次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。,次级代谢（前体聚合、,初级代谢 结构修饰、装配）,营养物 前体 次级代谢物,（初级代谢物）,次级代谢的生物学意义,次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。,维持初级代谢的平衡,次级代谢产物作为储藏物质的一种形式,使菌体在生存竞争中占优势,与细胞分化有关,青霉素,S CH,3,R-CO-,NH-HCCH C,B,A,CH,3,OC-N-CH,COOH,侧链：,R-CO-,母核：噻唑环,A,，,-,内酰胺环,B,青霉素的生物合成,代谢调节,细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。,代谢调节的位点,DNA,RNA,酶,底物,底物,产物,（营养物）（或中间物）,底物进入，酶的活性，酶的合成,代谢调节的本质：酶的调节,酶合成的调节：诱导与阻遏基因水平,酶活性的调节：反馈抑制蛋白质水平,适应现象,例,1，,大肠杆菌乳糖代谢：,半乳糖苷酶,乳糖-半乳糖+葡萄糖,E.coli生长于无乳糖培养基，,半乳糖苷酶：,3 分子/细胞,E.coli生长于含乳糖培养基，,半乳糖苷酶：,3000-5000 分子/细胞,例,2，,大肠杆菌色氨酸代谢：,E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶，,当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。,细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。,乳糖：,诱导物,(inducer),色氨酸：,辅抑物,(corepressor,),底物与诱导物,底物不等于诱导物,对,半乳糖苷酶,乳糖,IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,苯基半乳糖苷,苯基硫代半乳糖苷,作底物,+,-,+,-,作诱导物,+,+,-,-,乳糖操纵子,i P O Z Y A,调节基因 i：编码阻遏蛋白,启动子 P：有CAP(CAP与cAMP复合物)和RNase两个位点,操纵基因 O：阻遏蛋白结合位点,结构基因 Lac Z：,半乳糖苷酶,Lac Y：,半乳糖苷透性酶,Lac A：,半乳糖苷转乙酰酶,协同诱导和顺序诱导,协同诱导,I a、b、c,a b c,顺序诱导,A B C D,I a,B b,C c,操纵子,(operon),I P O S1 S2 S3,调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因,变构 ,(+or-),外界信号调节蛋白,I or CoR,操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。,诱导与阻遏,调节,调节蛋白活性 操纵子 结构基因 酶合成,诱导 正 打开 表达 ,诱导 负 打开 表达 ,阻遏 正 关闭 不表达 ,阻遏 负 关闭 不表达 ,反馈抑制,反馈抑制：,在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。,E1 E2 E3 E4,A,B C D E,反馈抑制能对环境变化做出快速反应,特点：,1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制,2，受抑制的是途径中的第一个酶,3，反馈抑制是可逆的,别构酶,(allosteric enzyme),有多亚基和四级结构,有结合底物的活性中心和结合调节物的别构中心,活性中心和别构中心在酶分子的不同部位,分支生物合成途径的调节,P,1,A,B,C,P,2,协同反馈抑制,同功酶反馈抑制,累积反馈抑制,顺序反馈抑制（细调）,协同反馈抑制,P,1,A,B,C,P,2,合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。,同功酶反馈抑制,P,1,A,B,C,P,2,合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。,积累反馈抑制,P,1,A,B,C,P,2,每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。,顺序反馈抑制,P,1,A,B,C,P,2,合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。,这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。,在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。,第三章 微生物的遗传与菌种选育,微生物的遗传物质,基因突变,基因重组,遗传育种,微生物的遗传物质,核酸,(DNA RNA),染色体,染色体外遗传物质,DNA,是遗传物质的实验证明,肺炎双球菌转化,S-dead，S-alive，R-alive,S ,dead-S-S,R,噬菌体感染,T2(DNA-,32,P,protein-,35,S),-E.coli-上清,T2（,35,S）,沉淀,E.coli（,32,P,）,双螺旋模型,遗传育种,基本过程,基因突变、重组、导入、敲除 筛选,出发菌株,包含变异株的群体 优良变异株 目的株,检验,检验,产生变异株,选择变异株,检验变异株,基因突变,遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几对碱基，又称点突变。,基因突变的类型,基因型,置换：,G,A,CT,转换,(,transition,)；G,A,C,T,颠换,(,transversion,),移码(frameshift)：,DNA,分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失,表型,形态：造成形态发生改变的突变,致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变,条件致死：在一定条件下有致死效应的突变,生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等,翻译,同义、错义、无义,(UAG,UGA,UAA),基因突变的特性,稀有性 突变率低（可通过理化处理提高突变率）,随机性,独立性,Km,r,10,-5,Ap,r,10,-6,Km,r,Ap,r,10,-11,可逆性 回复突变率也很低,稳定性,突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。,几种微生物每次复制的突变率,微生物,基因组大小（,bp,）,突变率,（碱基）,突变率,（基因组）,噬菌体M13,6.4,10,3,7.2,10,7,0.0046,噬菌体,4.9,10,4,7.7,10,8,0.0038,噬菌体T2、T4,1.7,10,5,2.4,10,8,0.0040,大肠杆菌,4.6,10,6,5.4,10,10,0.0025,酿酒酵母,1.2,10,7,2.2,10,10,0.0027,粗糙脉胞菌,4.2,10,7,7.2,10,11,0.0030,平均,0.0034,诱变剂,能引起微生物遗传物质发生改变的化学物理因子,化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）,烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）,物理：短波（紫外线）,射线（X-射线、,射线）,诱变剂的作用,诱变剂,诱变作用,对DNA的影响,诱变能力,5-溴尿嘧啶,碱基错配,转换(AT,GC),弱,羟胺,胞嘧啶脱酰胺,转换(GC,AT),弱,亚硝酸,A、C、G脱酰胺,转换(AT,GC)、缺失,中,亚硝基胍,A、C烷基化,转换(GC,AT),强,硫酸二乙酯,A、C烷基化,转换(GC,AT),强,溴化乙啶,嵌入碱基对,移码,弱,紫外线,嘧啶二聚,转换(GC,AT)、巅换、缺失、移码,中,射线,DNA单链或双链断裂,结构改变、缺失,强,基因突变的应用-诱变育种,虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。,诱变育种的基本步骤：,出发株诱变剂处理初筛复筛鉴定,一般要进行多次，以积累有益突变。,诱变谱系：,诱变剂处理1 诱变剂处理2,出发株 中间株1 中间株2 目的株,诱变育种的关键环节,出发株：性状、潜力,诱变处理：诱变剂选择、剂量,筛选：方法、筛选量,High-throughput screening,致死率与诱变效果,突变株的筛选,初筛：弃去大量无价值菌株,复筛：选出少数有价值菌株,方法：,直接测定,利用可观察现象,营养限制培养基,选择培养基,组成型育种,半乳糖苷酶,加诱导酶抑制剂,培养基：,乳糖+邻硝基-,-D-,岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）,只有组成型能利用乳糖,交替培养法,培养基1：乳糖,培养基2：葡萄糖,交替培养使组成型优势扩大,交替培养法,组成型,诱导型,组成型：诱导型,10,6,10,6,1:1,乳糖,10,6,-10,8,10,6,2,x,10,6,50:1,葡萄糖,10,7,-,10,9,2,x,10,5,-2,x,10,7,50:1,乳糖,10,8,-,10,10,2,x,10,6,-4,x,10,6,2500:1,葡萄糖,10,9,-10,11,4,x,10,5,-4,x,10,7,2500:1,乳糖,10,10,-10,12,4,x,10,6,-8,x,10,6,125000:1,葡萄糖,10,11,-10,13,8,x,10,5,-8,x,10,7,125000:1,营养缺陷型育种,营养缺陷型 C,-,A,B C B 积累,A,B C D 积累,D,抗反馈抑制育种,原理：,产物+酶（结合于调节中心）,反馈抑制,类似物+酶（结合于调节中心）,影响生长,抗类似物的变异株,类似物与酶的调节中心不能结合,产物与酶的调节中心不能结合,反馈抑制解除,产物能过量积累,抗反馈抑制育种举例,苏氨酸,C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml,MNNG,LR-1458 AHV,r,6mg/ml ,A),：使G的7位和A的3位N部分甲基化，中性pH加热，G(少量A)碱基脱落，再用0.1 mol NaOH处理，加热到90,C,使糖基脱落,硫酸二甲酯处理后加稀酸:A先断裂,(A,G),，再用0.1 mol NaOH处理，加热到90,C,使糖基脱落,DNA与肼反应,(C+T),：C、T脱落成核糖脲，与哌啶作用在C、T处切断DNA,DNA与肼反应时加2M NaCl,(C),：可抑制T脱落,双脱氧法,4种反应体系中掺入ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP，反应分别止于A、C、G、T,控制dNTP与ddNTP的比例，可得不同长度的DNA片段,M13噬菌体序列分析系统,M13,噬菌体：丝状噬菌体，基因组为环状单链,DNA，在细胞内的复制型(RF),为环状双链,DNA,MCS LacZ,M13mp18,(7.25kb),质粒的稳定性,质粒稳定性的检测方法：,100%,一定代期或时间,选择性培养基,非,选择性培养基,非,选择性培养基(M),选择性培养基(m),质粒丢失率,=(M-m)/M 100%,质粒不稳定性的分类,分离不稳定性(segregational instability)：,质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失,结构不稳定性(structural instability)：,重组质粒外源DNA的丢失或发生缺失、插入、重排等,分离不稳定的影响因素与改善途径,影响因素,载体类型,克隆DNA的来源,质粒大小,质粒拷贝数,分配功能,温度,改善途径,选择恰当质粒,确定适宜的克隆基因来源,限制插入片断大小,用高拷贝数质粒,引入稳定功能或编码必需产物的基因,结构不稳定的影响因素与改善途径,影响因素,强启动子的存在，产物过量可能影响质粒的复制等功能,DNA复制时经过单链为中介，引起分子内重排,DNA重复序列在复制时引起缺失,改善途径,用低拷贝数质粒或染色体插入载体,用热诱导启动子，时间控制基因表达,引入使单链DNA高效转化为双链DNA的序列,除去引起缺失作用的序列,期中思考题,请各列举1个可应用微生物来解决的实际问题和不可应用微生物来解决的实际问题，并简单说明理由。,