蛋白免疫印迹法Westernblot原理和步骤.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,Western Blot的原理,Western Blot,：,首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术主要应用于检测蛋白水平的表达。,SDS-PAGE原理,SDS-PAGE,：是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，,SDS,是一种很强的,阴离子表面活性剂,，它可以,断开分子内和分子间的氢键,，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物,蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,Western blot 内容,蛋白样品的制备,SDS-PAGE,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,步骤,蛋白样品的制备,1，在冰上收细胞，用PBS清洗两次，,洗,去培养基。1500r,5min离心，弃去上清液。,2，裂解细胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根据所需蛋白浓度加细胞裂解液。混匀。于冰上裂解20min,。,3，14000r,10min离心。上清液即为所需蛋白样品液。,4，用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度。,5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例，向蛋白样品液中添加loading buffer。,6，于95,，5min条件下对蛋白样品进行高温变性。,SDS-PAGE:,1,，灌胶,：,（,1,）保证玻璃板干燥洁净，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。,（,2,）配好分离胶，加入,TEMED,，混匀后即可灌胶。灌胶过程中胶要沿着玻璃板流下，防止有气泡产生。将胶灌至接近绿带中线即可。,（,3,）用去离子水进行液封，胶凝速度会更快（加水时速度要慢，防止胶被冲变形）,（,4,）待水与胶之间有一条折射线的时，说明胶已经凝固。此时，可完全除去胶上层的水。,（,5,）配制浓缩胶，加入,TEMED,混匀后将剩余空间灌满浓缩胶。然后插入梳子。待浓缩胶凝固后小心拔出梳子。,（,6,）用水冲洗一下胶板，装入电泳槽中（小玻板面向内，大玻板向外；若只跑一块板，槽的另一边要放一块塑料板，有字的一面向外）,2,，电泳,向电解槽中加入适量的,Running Buffer,将蛋白样品以,50ug,的标准换算出的体积进行上样。以电压,120V,或,160V,进行电泳，电泳至前沿跑至最底端即可进行转膜。,转膜,用硝酸纤维素膜（,NC,膜），进行转膜。组装转膜“三明治”的过程在,Transfer buffer,中进行：黑的一面在下，依次放上滤纸、凝胶、,NC,膜、滤纸，然后合上三明治。整个过程必须保证无气泡。接着把转膜“三明治”放入转膜槽中，注意正负极放置正确。倒入适量的,Transfer buffer,。在冰浴中进行转膜。转膜条件：,120V,1.5h,或者,150V,，,1h,封闭,转膜结束后，取出,NC,膜，按照所需蛋白的位置，裁剪,NC,膜。使其浸润于封闭液中，缓慢摇荡,1h,一抗杂交,封闭过后，把,NC,膜放入塑料袋中，按膜的大小加入适量的一抗溶液（一抗：封闭液,=1:1000,），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育,4h,。,二抗杂交,一抗孵育完成后，取出,NC,膜，交替加入,TBST,和,TBS,进行洗膜，一共洗三次，每次,710min,。然后，再将,NC,膜放入塑料袋中，加入酶标二抗（一抗的抗体，含辣根过氧化物酶,HRP,）（二抗：封闭液,=1:1000,），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育,45min1h,。最后再次洗膜（同上）,底物显色,取上述处理过的,NC,膜，于干燥洁净的的玻璃板上，适当晾干。按照体积比,1:1,取鲁米诺和过氧化氢，混匀，滴加到,NC,膜上，,保证,NC,膜完全浸润其中。静置,3min,，使反应完全。然后适当控干多余液体，将其平整的包裹于保鲜膜内，赶走气泡。将边缘折叠整齐，放入暗盒内，用标签纸贴牢。然后进行曝光即可。,