单克隆抗体的制备讲解.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,Page,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,单击此处编辑母版标题样式,*,单克隆抗体的制备讲解,什么是单克隆抗体？,1,、单克隆抗体（,monoclonal antibodies,mAb,）：,由单个,B,淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。,与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。,单克隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,单克隆抗体杂交瘤技术基本流程,在培养基中加入氨基,嘌呤,，收集增殖细胞！,3,种杂交细胞：,B-B,融合细胞、杂交瘤细胞,瘤,-,瘤融合细胞,未融合的细胞：单个的,B,细胞、单个的骨髓瘤细胞,这五种细胞中，,没有分裂能力，逐渐衰老死亡；,的,DNA,复制只有,D,途径，,加入氨基嘌呤后，使,D,合成途径阻断，也逐渐衰老死亡，,但,的,DNA,复制有,D,、,S,两条途径，虽然,D,途径被氨基嘌呤阻断，但是还可以通过,S,途径进行,DNA,的复制，使细胞有分裂能力。,单克隆抗体的制备步骤,一：免疫原的制备：,1,：,完全抗原,：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于,5000Da生物物质,2,：,半抗原,：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于,5000 Da 物质,3,：半抗原需与,BSA、O,V,A等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体,单克隆抗体的制备步骤,免疫动物的选取：,6-8,周龄的雌性，纯系的,Bal B/C,。,免疫原：,细胞性抗原,：（,1,2,）,10,7,/,只，,不加佐剂，,23,周重复一次,可溶性抗原,：首次，完全福氏佐剂,+100,微克抗原，,36,周,100200,微克抗原，融合前,3,天，加强免疫。,免疫程序,：免疫剂量、免疫途径、免疫次数、,间隔时间、佐剂的选择。,二,.,动物免疫,单克隆抗体的制备步骤,抗原接种,单克隆抗体的制备步骤,三：,细胞融合,细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的,B,淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在,PEG,融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了,B,淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。,所需试剂：,培养液,：,RPM1640,培养液，,DMEM,培养液，,HAT,培养液，,HT,培养液,细胞融合剂,：,PEG:,分子量,4000,的,PEG,是最常用的细胞融合剂,作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而,有助于细胞融合,作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的,PEG,，其纯度,与毒性有所不同,单克隆抗体的制备步骤,三,.,细胞融合,步骤,1,：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。,单克隆抗体的制备步骤,1：将脾细胞和骨髓瘤细胞5:1混合，加DM液，混匀,2：离心，弃上清，磨成糊状,3：将离心管置于37温水，摇动；边滴加PEG1450,4：加入DM液,5：离心，弃上清,6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱,7：五天后，15%血清的HAT补液,8：八天后，彻底换15%血清DM液,三,.,细胞融合,ELISA方法筛选阳性孔,单克隆抗体的制备步骤,四,.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,阳性孔,单克隆抗体的制备步骤,用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。,抗原抗体杂交法检测,呈阳性反应,四,.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,间接ELISA方法筛选阳性孔,单克隆抗体的制备步骤,六：亚克隆,是为了获得稳定的阳性菌株,对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失,单克隆抗体的制备步骤,筛选阳性细胞孔,HAT,重悬阳性孔内的细胞,取,10ul,做倍比稀释,目标孔：,80-100,个细胞,将目标孔细胞全部移至适量的,HAT,溶液中，铺板,每次亚克隆十天后，用,ELISA,法做抗体检测，确定阳性孔,按上述方法进行第二，第三次亚克隆,第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养,六：亚克隆,每次亚克隆后要进行细胞的冻存保种,单克隆抗体的制备步骤,1,：,在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细,胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故,。,2:,配制方案,：,DMEM:,血清：,DMSO=7,：,2,：,1,“,慢冻,”,：,分步冷冻，,30-70,液氮,保存,数年至数十年,.,“,快融,”,：取出立即浸入,37,40,水浴中，使其迅速融化、复,苏,.,七：杂交瘤细胞的冻存与复苏,细胞冷冻的意义,防止污染 、,避免染色体丢失、,防止非分泌细胞的过度生长、防止细胞密度过高而死亡,单克隆抗体的制备步骤,八：,如何得到大量的单克隆抗体？,动物体内诱生法：,使用的动物当然首选,BALB/c,小鼠,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。,体外培养法：,a,、悬浮培养法,b,、微载体培养法,Microcarrier,c,、中空纤维细胞培养系统,d,、微囊化细胞培养系统,收集细胞培养瓶中的杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用,无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有的牛血清洗净,防止牛血清进入,了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的选择上一定要选择活力好、腹腔大的小鼠。当,小鼠腹腔开始发胀后,每天密切关注小鼠状态,取出腹水,立即离心,去除上层的腹腔脂肪,下层有时会出现细胞,除去。,离心后马上进行纯化。,单克隆抗体的制备步骤,饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法,离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离,辛酸一饱和硫酸铵法,_在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。,九：单克隆抗体的纯化,单克隆抗体的鉴定,单克隆抗体纯度的鉴定,:,用,SDS,一,PAGE,电泳鉴定纯度,单克隆抗体敏感性,(IC50),值的测定,:,间接竞争,ELISA,实验中,一般是通过,IC50,值来判断抗体对,CAP,的敏感性,故用,7,个不同偶联比的,HAP,一,OVA,进行,ELISA,实验,测定不同偶联比的包被抗原对应的,IC50,值。,单克隆抗体特异性的测定,(,交叉反应,),做间接竞争,ELIsA,计算各自的,ICS,。值,计算交叉反应率。,如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉反应,将测定,结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体,特异性越好。,7.,单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定,将单抗腹水与,Sigma,公司的标准抗,BALB/C,小鼠,IgA,IgG,1,IgG,2a,IgG,2b,、,IgG,3,IgM,抗体，作双向琼脂扩散试验。,ELISA方法,用常规间接,ELISA,方法检测单抗腹水效价，腹水效价在,10,5,10,7,之间的可用于实际应用。,文献学习,氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立,胶体金免疫检测的基本原理,胶体金,(colloidal gold),是在还原剂如氯金酸、梓檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞋酸等作用下,29,首先聚合成为具有一定大小的金核颗粒,在颗粒外侧形成内正外负的两层带负电荷的疏水胶体溶液,再借助静电作用和蛋白结构中的正电荷结合形成一种稳定的胶体状态。这种静电力不会改变蛋白质的空间结构故不影响其自身的生物学性质。,金溶胶颗粒直径与制备时加入的梓檬酸三钠的用量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的梓檬酸三钠用量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径,(8-160nm),的金溶胶。梓檬酸三钠用量越多,胶体金颗粒的直径越小,梓檬酸三钠的用量越少,胶体金颗粒的直径越大。,