DB34∕T 3987-2021 禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程(安徽省).pdf

ICS 11.220 CCS B 41 34 安徽省地方标准 DB34/T 39872021 禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程Technical regulations for cell culture, isolation and detection of avian leukemia virus 2021-09-03 发布 2021-10-03 实施安徽省市场监督管理局 发 布DB34/T 39872021 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所、桐城市畜牧兽医管理中心、合肥市动物疫病预防与控制中心、肥西县农业综合行政执法大队、滁州市动物疫病预防与控制中心、望江县畜牧兽医技术推广中心、宣城市动物防疫站、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽省新联禽业股份有限公司、阜南县农业农村局、池州市动物疫病预防与控制中心。 本文件主要起草人：沈学怀、王华付、司宏富、董先敏、季晶晶、胡江苗、程帮照、潘孝成、戴银、张丹俊、尹磊、赵瑞宏、胡晓苗、钱昌银、刘华、陈辉、翟银建、江美莲。 DB34/T 39872021 1 禽白血病病毒细胞培养分离检测技术规程 1 范围 本文件规定了禽白血病病毒细胞培养分离检测的血浆、精液、蛋清和肛拭子样品处理与接种、细胞样品的检测等技术内容和要求。 本文件适用于禽白血病净化中血浆、 精液、 蛋清和肛拭子样品中禽白血病病毒的细胞培养分离检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 26436 禽白血病诊断技术 GB/T 36873 原种鸡群禽白血病净化检测规程 NY/T 680 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽白血病病毒 avian leukosis virus，ALV ALV 属于反转录病毒科的反转录病毒属。ALV 可分为 AJ 10 个亚群，其中 A、B、C、D、E 和 J亚群病毒与鸡的禽白血病相关，可诱发鸡不同组织的良性和恶性肿瘤。 A、B、C、D 和 J 亚群属外源性 ALV，与禽白血病的不同类型肿瘤发病相关。 E 亚群病毒为内源性病毒，其致病性很低或没有致病性。 3.2 鸡胚成纤维细胞系 DF-1 chicken embryo fibroblast cell line DF-1 为鸡胚成纤维细胞的自发永生化细胞系。 4 接种样品的准备 4.1 血液样品的准备 4.1.1 血液的采集 用消毒酒精棉球对鸡翅下静脉部位进行消毒，使用 1 mL 一次性注射器或真空采血管进行采血，使用 1 mg/mL 肝素钠作为抗凝剂。使用 1 mL 注射器时先吸入 0.1 mL 肝素钠，采血至 1 mL，或使用含肝素钠抗凝剂的真空采血管采血 12 mL。 DB34/T 39872021 2 4.1.2 血浆的分离与保存 采集的鸡抗凝血样品应保存在 4环境下，采集的鸡血液样品应尽快处理并接种 DF-1细胞，保存期限最长不超过 6 h， 否则应重新采样。 将鸡抗凝血样品转移至灭菌离心管中， 2000 r/min 离心 2 min，备用。 4.2 公鸡精液样品的准备 4.2.1 公鸡精液的采集 应按照 GB/T 36873 中规定的方法进行种公鸡精液的采集。 4.2.2 公鸡精液样品的保存与处理 采集的公鸡精液样品应保存在 4环境下，保存期限不超过 6 h。在无菌的 1.5 mL 的离心管中，加入精液样品 40L，加入精液稀释液 160L，振荡混匀，在 4条件下 10000 r/min 离心 5 min，备用。 4.3 鸡蛋清样品的准备 4.3.1 鸡蛋清样品的采集 清洗和消毒鸡蛋表面，在无菌操作台中，用鸡蛋开孔器在鸡蛋的气室端开口，无菌 100L 蛋清样品转移至灭菌离心管中暂存，使用鸡蛋开孔器时应避免样品间交叉污染。 4.3.2 鸡蛋清样品的保存与处理 采集的蛋清样品应保存在 4环境下， 保存期限不超过 6 h。 在 100 uL 蛋清样品离心管中加入 100L灭菌 PBS，充分混合后，备用。 4.4 肛拭子样品的准备 肛拭子样品的采集和处理应按照 GB/T 26436 中的方法执行，肛拭子样品应保存在 4环境下，保存期限不超过 6 h。 5 接种细胞的准备 取生长状态良好的 DF-1细胞，常规传代消化，调整细胞密度为 1105 个细胞/mL，接种于 24 孔细胞培养板中，每孔接种 1 mL。待细胞生长至占细胞贴壁面 70时，弃去孔中的培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞面三次后，可用于样品的接种。 6 样品接种 6.1 鸡血浆样品的接种 将 4.1.2 中处理后的血液样品用移液器吸头轻轻旋转上层血浆，使处于中层的白细胞悬浮于血浆中，吸取 100L 血浆接种到 DF-1细胞培养孔中，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记，并在每个细胞培养孔中加入 40L 肝素钠溶液，防止血浆凝固。 DB34/T 39872021 3 6.2 公鸡精液样品的接种 将 4.2.2 中处理后的精液样品按照 GB/T 36873 中的方法进行种公鸡精液样品的接种，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。 6.3 鸡蛋清样品的接种 将 4.3.2 中处理后的蛋清样品， 每个样品取 100L 接种到 DF-1细胞培养孔中， 另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。 6.4 肛拭子样品的接种 应按照 GB/T 26436 中的方法执行，另设阴阳性对照孔，样品孔做好标记。 7 细胞的维持培养 将接种样品后的细胞板放入细胞培养箱继续孵育 3 h 后，弃去细胞培养孔中液体，用 200L 灭菌 PBS 润洗细胞孔 1 次，加入细胞维持培养液 1 mL，继续培养 79 天，在细胞状态允许的条件下应尽可能延长细胞维持培养的时间，以利于 ALV 在细胞上的增殖。在 24 孔培养板靠边的样品孔中多加入 0.3 mL 细胞维持培养液，以补偿样品孔的水分蒸发。 8 病毒的检测 8.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测 ALV p27 抗原 应按照 NY/T 680 中规定的方法执行或采用符合 NY/T 680 要求的商品化试剂盒进行检测，并按照试剂盒说明书执行。 8.2 间接免疫荧光抗体反应（IFA）方法检测 ALV 抗原 应按照 GB/T 26436 中规定的方法执行。 8.3 聚合酶链式反应（PCR）方法检测 ALV 核酸 应按照 GB/T 26436 中规定的的方法执行。 DB34/T 39872021 4 附录A （资料性） 试剂的配制 A.1 细胞完全培养液(pH 7.2) DMED 高糖培养液（商品化） 450 mL 胎牛血清 50 mL 青霉素 100 U/mL 链霉素 0.1 mg/mL A.2 细胞维持液 DMED 高糖培养液（商品化） 495 mL 胎牛血清 5 mL 青霉素 200 U/mL 链霉素 0.2 mg/mL A.3 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L ，pH 7.4） 氯化钠 8 g 氯化钾 0.2 g 磷酸二氢钾 0.2 g 十二水磷酸氢二钠 2.83 g 蒸馏水 加至 1000 mL 在温度 121、压力 0.12 Mpa 条件下灭菌 15 分钟。 A.4 D-Hanks 缓冲液 氯化钠 8 g 氯化钾 0.9 g 磷酸二氢钾 0.06 g 十二水磷酸氢二钠 0.152 g 葡萄糖 1 g 蒸馏水 加至 1000 mL 分装于 200 ml 小瓶中， 在温度 121、 压力 0.12 Mpa 条件下灭菌 15 分钟， 临用前用无菌的 5.6 NaHCO3 调 pH 至 7.27.6。 A.5 0.25胰酶消化液 D-Hanks缓冲液 100 mL 胰酶（粉末） 0.25 g DB34/T 39872021 5 0.5 mol/L EDTA 1 ML 用 1 mol/L NaOH 调节 pH 至 7.27.4，用 0.22 um 的滤器过滤除菌。 A.6 1 mg/mL 肝素钠 肝素钠（粉末） 0.1 g 生理盐水 100 mL 溶解后用 0.22 um 的滤器过滤除菌。 A.7 精液稀释液 青霉素 5万单位 链霉素 50 mg 两性霉素B 0.1 mg 磷酸盐缓冲液（PBS） 100 mL 溶解后用 0.22 um 的滤器过滤除菌。