第八章-体外试验与生物新技术在毒理学中的应用.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2013/12/8,#,体外试验与生物新技术,在毒理学中的应用,第八章,第一节 体外试验,体外试验的必然趋势,:,大量新化学物成为食品成分；,整体动物试验需消耗大量时间和经费；,动物保护主义兴起；,生物技术的发展和进步。,3,体,外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。,依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为,3,类：,筛选试验：,提供决策过程的最初的资料。,附加试验：,为协作部门或法律部门的最终决策过程提供资料，但仅有它是不够充分的。,替代试验：,在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验。,体外试验的基本原理,体外试验的基本原理,是所观察到的毒理学效应均是毒物和或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。,体外试验的前提条件,是将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，,在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，,体外试验的优点,能控制环境因素；,可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响；,快速、经济；,易于利用人体细胞，较好地解决物种差异的问题。,体外试验的缺点,体外到体内外推的问题,体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，,如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系,的问题是最终未解决的难题。,它需要更好的工具,预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的,毒物代谢动力学模型,。,体外试验的缺点,体外毒性试验难以预测慢性毒性,因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。,二、肠灌流技术,利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的,吸收及动力学,过程。,如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将,肠两端插管,，清洗净肠中内容物，在,恒温,环境中灌入灌流液。,三、脏器灌流的优缺点,优点：,在接近生理状况的条件下研究脏器功能；,保持了完整的脏器和细胞结构及生理生化特性；,排除其他组织、脏器的干扰；,便于严格控制受试物浓度；,易于采样分析。,缺点：,只能在有限的时间内进行；,操作复杂。,第三节 细胞毒理学在毒理学中的应用,到目前为止，,分离的细胞,是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系统分离的细胞包括悬浮液中的,新鲜游离细胞,、,原代培养细胞,、,细胞株,、,细胞系,及,复合培养的细胞,。,一、细胞毒理学兴起的原因,公众要求减少实验中使用,动物数量,；,非整体动物实验可显著地减少常规整体动物实验所需的高额,费用,；,人们越来越不满意实验动物与人体结果之间,相关性,的缺乏。,15,16,表,12-3,毒理学研究中常用细胞,各种物种的成纤维细胞,淋巴母细胞,腹水瘤细胞,淋巴细胞,角质细胞,肝,细,胞,肝癌细胞,肾脏髓质和皮质细胞,肺的各种类型细胞,培养的背根胶质细胞,培养的睾丸细胞,膀胱细胞,心脏,细,胞,脊髓微血管细胞,脂肪细胞,二、细胞培养仪器与设备,离心机、消毒灭菌设备、超净工作台,水纯化装置,PH,计,渗透压仪,过滤消毒装置,二氧化碳培养箱：,5%CO,2,、,95%O,2,，饱和湿度。,倒置显微镜,培养器皿：细胞培养瓶、培养皿、多孔培养板,三、细胞培养在毒理学中的应用,（一）细胞类型的选择,选择,迅速生长的细胞株,，用以观察受试物对整体细胞的,一般毒作用,；,机理研究多不用细胞系。,（二）代谢活化,培养细胞对需代谢活化的化学物不敏感；,解决方法：,加,S9+NADPH,生成系统,与原代肝细胞混合培养,（三）受试物的给予,水溶性低的受试物,：先溶于,有机溶剂,，再加入培养液中（需设有机溶剂对照）,有机溶剂在培养液中的浓度应低于,1%,；,需添加,S9,时，有机溶剂浓度应低于,0.1%,。,不溶性受试物,：混悬于培养液,（四）观察指标,细胞形态,细胞存活率：台盼蓝染色（着色者为死亡细胞）,IC,50,：半数抑制浓度,代谢能力：检测代谢酶、底物等,生物大分子的合成与降解：,RNA,、蛋白质,四、亚细胞组分在毒理学在的应用,将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入研究外源化学物的,靶位点,、探讨化学物,毒性效应的机理,均十分重要。,亚细胞组分主要用于毒作用的,分子机制,研究。,现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是,线粒体,、,微粒体,及,细胞膜,。,第四节 分子毒理学在毒理学中的应用,一些常用的分子生物学技术，如,PCR,技术、核酸杂交技术、,DNA,测序技术,以及一系列突变检测技术已广泛应用于外源化合物和环境致癌物引起的,DNA,损伤、基因突变、加合物形成及癌基因和抑癌基因研究等方面。特别是近年来,基因差异分析技术、转基因技术、基因芯片技术,等分子生物学新技术的建立和引入，大大提高了毒理学研究的整体水平。,24,一、,PCR,技术,PCR(polymerase chain reaction),技术称,聚合酶,链式反,应技术,，又称无细胞克隆技术,(,“,free Bacteria,”,cloning technique),，是一种对特定的,DNA,片段在体外进行快速扩增,的新方法。,二、,mRNA,定性与定量测定,许多外源化学物和内源性活性物质皆可引起基因表达的改变，主要是,基因转录水平的变化,。对,mRNA,的测定在此类研究中尤为重要。,通常采用,northern,杂交,、,核酸原位杂交,检测,mRNA,。,三、转基因技术,导入的外源基因对遗传损伤敏感性高，导入动物体内后其敏感性仍高，可在低剂量下检测，特别适宜于观察,慢性低水平接触,时的,DNA,损伤。,采用转基因技术,可建立,转基因动物模型,，用于研究毒效应机制。,四、基因芯片技术,基因芯片技术是一种高效准确的,DNA,序列分析技术，将基因芯片应用于,检测基因突变,，不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，更主要的是它的快速高效而为目前应用的直接测序法所无法比拟，它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的所有突变，是对基因突变检测技术的一次重大突破。,