蛋白表达概述.ppt

,*,*,蛋白表达概述,Michael Chao,常用蛋白表达系统,(host),原核细胞：大肠杆菌,。,真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞,大肠杆菌表达系统,大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。,优越性：,对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；,商品化的载体和菌株种类非常齐全；,表达效率高；,易培养，成本低。,缺点：,因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；,蛋白质不能糖基化；,其内毒素很难除去。,酵母表达系统,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以,Pichia Pastoris,应用最多。,优越性：,蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；,表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；,表达载体都为,E.coli/Pichia Pastoris,的穿梭载体，可在获得克隆后采用,E.coli,细胞大量,扩增。,易培养，成本低,可高密度发酵。,缺点：,糖基化与哺乳动物有所差别；,培养上清多糖浓度高，不利于纯化。,昆虫细胞表达系统,利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。,优越性：,重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；,可容纳较大片段的外源,DNA,插入，因此是表达大片段,DNA,的理想载体；,可进行分泌表达。,缺点：,糖基化与哺乳动物有所差别；,表达量有限；,作为药物宿主细胞未被,FDA,认可；,培养成本高。,哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。,优越性：,糖基化与人源蛋白一致；,能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；,可进行分泌表达。,缺点：,表达量低；,培养成本很高，操作繁琐。,表达载体,(Vector),原核表达载体众多，常用的有,pET(T7 promoter),、,pQE(T5 promoter),、,pGEX(GST,融合表达,),等。,各载体适应的菌株也不尽相同,pET(BL21(DE3),、,pQE(M15,JM109),、,pGEX(BL21),。,对于我们来说，最常用和最需掌握的是,pET,表达系统,Expression plasmid features,Induction of expression,pET,载体,E.coli,表达蛋白流程,pET system,Fetures:,popular,Low basal expression levels,Widest variety of fusion tags,Specialized vectors and hosts,Competent cells,选择合适的载体,载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。,转录载体,用以表达本身带有原核核糖体结合位点和,AUG,起始密码子的目的基因。只有,3,种转录载体：,pET-21(+),、,pET-24(+),和,pET-23(+),。,翻译载体,包括来自,T7,噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不带有核糖体结合位点的目的基因,选择合适的载体需要考虑的因素：,目的蛋白的应用,目的蛋白已知特定信息,克隆策略,目的蛋白的应用,分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是，能用于大量纯化的载体,-,宿主菌,-,培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体,-,宿主菌,-,培养条件的组合以便找到最佳条件，是非常值得的。,目的蛋白的已知特性,任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性要求一端或两端均无外源序列。大多数,pET,载体可以克隆非融合序列；但是，如果特定翻译起始序列在,E.coli,中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋白，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。,克隆策略,不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选择。许多,pET,载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的,PCR,克隆策略。,蛋白溶解性和细胞定位,一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。许多后续应用要求目的蛋白以有活性的可溶状态表达。大多数情况下，可溶性并非有或无的现象。,正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。载体可以通过三种方式增加可溶性：,1),与本身溶解性高的多肽序列融合表达,(GST,，,Trx,及,NusA),；,2),与催化二硫键形成的酶融合表达,(,例如,Trx,，,DsbA,，及,DsbC),；,3),与信号序列融合表达，输出到细胞周质。,包涵体有利于纯化：容易通过离心收获浓度高而相对纯净的蛋白；包涵体保护蛋白免受蛋白酶水解；毒性蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。,有意采用包涵体复性方法多用于制备抗原或用于不特别要求正确折叠的应用情况。,pET-17xb,以,N,端融合蛋白形式表达全长,220 aa T7,基因,10,蛋白,，,并形成包涵体。,pET-31b(+),也是表达融合蛋白包涵体的代表，非常适合制备小蛋白和多肽。,非融合表达，融合表达，分泌表达,P,SD,Foreign DNA,P,SD,Foreign DNA,融合表达载体,融合基因,P,SD,融合型表达载体,Foreign DNA,融合基因,IPP,STag,，,T7Tag,GSTTag,，,HisTag,TrxTag,，,NusTag,pET,载体的融合标签,E.coli,宿主菌,名称,特征,用途,抗性,DH5,带有,recA endA,突变的克隆菌株，由于,DH5,具有,deoR,变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。,常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。,无,BL21,lon,和,ompT,蛋白酶缺陷型,用于,PGEX,载体构建质粒的蛋白表达,无,BL21(DE3),lon,和,ompT,蛋白酶缺陷型，含有,lacI,抑制基因和位于,lacUV5,启动子下的,T7 RNA,聚合酶基因,用于含有,T7,的,pET,系列载体构建质粒的蛋白表达,无,BL21(DE3)-RP,在,BL21(DE3),细胞的基础上，具有额外拷贝的,argU,和,proL,基因,解决了表达富含,AT,的基因组蛋白密码子偏倚性问题,氯霉素,BL21(DE3)-RIL,在,BL21(DE3),细胞的基础上，具有额外拷贝的,argU,、,ileY,和,leuW tRNA,基因,解决了表达富含,AT,的基因组蛋白密码子偏倚性问题,氯霉素,BL21(DE3)-plysS,带有可以与,pET,共存的、编码,T7,溶菌酶（,T7 RNA,聚合酶的天然抑制物）的质粒。,pLysS,菌株在被诱导前,T7 RNA,聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有,pLacI,质粒的宿主菌产生额外的抑制,pETBlue,和,pTriEx,载体基础表达的,lac,阻遏蛋白,更严格的本底表达控制，,适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。,氯霉素,BL21(DE3)-Rosetta-gami,（,Rosetta-gami,）携带,pRARE2,质粒的,BL21,衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（,AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA,及,CGG,）稀有密码子对应的,tRNA,，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，又具有,thioredoxin reductase(trxB),和,glutathione reductase(gor),两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达,补充,7,种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性,卡那霉素、氯霉素、四环素,Rosetta-Blue,带有,recA endA lacI,q,突变的克隆菌株,高蛋白表达,补充大肠杆菌缺乏的,AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA,六,种稀有密码子对应的,tRNA,。,补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平,氯霉素,用于克隆的宿主菌,用于克隆的宿主菌通常是,K12,系列,NovaBlue,，,JM109,以及,DH5 a,。这些菌株是,recAendA,型,，,转化效率很高，且质粒产量高，适合用于保存带有克隆目的基因的,pET,载体。,用于表达的宿主菌,重组质粒转化到带有染色体,T7 RNA,聚合酶基因,(T7 gene 1),的大肠杆菌中，即可开始生产蛋白了；,所有,B,型菌株，,B834,，,BL21,，,BLR,，,Origami B,，,Rosetta,及,Tuner,都缺乏纯化过程中降解蛋白的,lon,蛋白酶及,ompT,外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。,BL21(DE3),是用得最多的表达菌；,AD494(DE3),和,BL21,trxB,(DE3),具有,trxB,突变，而,Origami(DE3),，,Origami B(DE3),和,Rosetta-gami(DE3),菌株带有,trxB,和,gor,双突变。拥有,trxB,和,gor,突,变的菌株比单具,trxB,突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更,高,；,多数氨基酸有不只一个密码子，而不同的生物使用这,61,种密码子的偏爱性不同。每种细胞里，,tRNA,种类和数量直接反映了其,mRNA,使用密码子的种类和数量的偏爱性。当外源目的基因,mRNA,在,E.coli,里过表达，由于密码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种,tRNA,，直接导致翻译终止或错误。,tRNA,不足会造成翻译停顿，早期翻译停止，移码突变，和氨基酸错掺等问题。,Rosetta,菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有,tRNA,水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。,表达条件,培养基；,抗生素；,诱导剂；,诱导温度；,诱导时机；,诱导时间。,培养基,适于,pET,系统宿主菌生长及表达目的,DNA,的生长培养基种类很多，包括,LB,，,TB,，,M9,及,M9ZB,等,抗生素和诱导剂,氨苄青霉素作为一种选择性抗生素的应用需要相当小心，因为,-,内酰胺酶的表达可以达到相当数量，并分泌到培养基中破坏所有的氨苄青霉素。另外由细菌代谢所造成的酸性环境也容易使氨苄青霉素水解。对于,pBR322,衍生质粒，一般采用,50g/ml,氨苄浓度，当培养基变混浊时（,10E7,细胞,/ml,）也就意味着氨苄的失效。,200g/ml,的氨苄浓度会使达到氨苄失效点的细胞浓度略有提高，但由于,-,内酰胺酶的催化活性，即使加再多的氨苄也很难使细胞生长达到饱和时仍维持选择压力。,表达条件优化,增加可溶性和折叠；,稀有密码子；,毒性基因及质粒稳定性；,其他因素。,增加可溶性和折叠,在许多应用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在,(,蛋白可溶并不意味着蛋白正确折叠,),。载体、宿主菌、蛋白序列和培养条件都会降低或升高蛋白可溶,/,不溶形式的比例。,在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导剂浓度，降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。,温度：,37,生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而,30,生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温,(15-20,),延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。,裂解缓冲液的性质会大大影响到目的蛋白可溶与不溶形式之间的比例。当采用一般的裂解缓冲液如,1His Bind Binding,缓冲液（包括,500mM NaCl,）时，一些包含疏水或膜相关结构域的蛋白可能被归于不溶部分。在裂解缓冲液中加入毫摩尔的非离子型或双性去污剂可以将由于与细菌脂或膜结合而不溶的蛋白组分转变成可溶组分。包含高电荷结构域的目的蛋白可能与其他一些细胞元件关联（如可能与,DNA,结合）。在这种情况下目标蛋白可能与细胞残余在一起，理论上可以在裂解缓冲液中加入盐或用,Benzonase,核酸酶消化核酸来解决这类问题。,TrxTag,、,GSTTag,和,NusTag,融合标签都是高度可溶的多肽，可增加目的蛋白的溶解性。,许多蛋白需要形成二硫键才得以正确折叠并产生活性，,Rosetta-gami,菌株不仅是硫氧还蛋白还原酶,(,trxB),突变体,，,还是谷胱甘肽还原酶,（,gor,）突变体，,这进一步增强了二硫键的形成。如果目的蛋白中含有一个或更多的关键二硫键，,pET-32a-c(+),载体与,Rosetta-gami,菌株的组合可能是最佳的选择。,稀有密码子,多数氨基酸都有一个以上的密码子，对,E.coli,密码子应用情况的分析表明一些密码子很少使用。尤其是,Arg,密码子,AGA,AGG,CGG,CGA,Ile,密码子,AUA,Leu,密码子,CUA,Gly,密码子,GGA,和,Pro,密码子,CCC,很少被用到。当异源目的基因的,mRNA,在,E.coli,中过表达时，,tRNA,的数量直接反映了,mRNA,的密码子偏倚性。由于一个或多个,tRNA,的稀有或缺少可能导致翻译的停止。不充足的,tRNA,库可能导致翻译延迟、成熟前翻译终止、翻译移码和氨基酸错配。,尽管少量稀有密码子的出现通常不会给目的蛋白的合成造成太大影响，不过如果一个基因中含有成串或多个,E.coli,稀有密码子，外源蛋白的表达将非常低。目的基因中含过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因。,Rosetta,菌株被用来增加含有稀有,Arg,密码子,AGG,和,AGA,，,Ile,密码子,AUA,，,Leu,密码子,CUA,Pro,密码子,CCC,和,Gly,密码子,GGA,目的蛋白的表达。,tRNA,由一个与,pET,载体相容的氯霉素抗性质粒,(,以,pACYC,为骨架,),带有的自身启动子所表达。,毒性基因及质粒稳定性,pBR322,质粒及其衍生型（包括,pET,载体）在宿主菌中相当稳定，即使在没有抗生素压力的情况下培养数代，大部分宿主菌中仍保有这些质粒。如果克隆入质粒的外源基因产物对宿主菌具有毒性，就会遇到质粒不稳定的问题,在,pET,系统中，可在菌株生长已受损害的情况下维持质粒的存在和一定表达水平；缺乏质粒的细胞可能由于质粒拷贝数的降低或其他原因，其数量有所增加。在这种情况下，若没有选择压力，不含质粒的细胞将很快生长。如果要使大部分细胞都含有质粒，培养基中一定不能没有抗生素。,带有不稳定质粒的菌株在有氨苄抗生素选择压力的情况下生长，一旦足够的,-,内酰胺酶分泌破坏了氨苄青霉素之后，缺乏质粒的细胞将不再被杀死，并开始快速生长。,pLysS,溶原菌对带毒性基因的载体的耐受性有所提高：不稳定的质粒变得稳定，可以达到最低的本底表达，防止毒性基因泄露。对于毒性极大的基因，带有,T7lac,启动子的质粒和,pLysS,宿主菌是最佳选择。,没有了来自,pLysS,质粒的,T7,溶菌酶，细胞稳定期本底表达水平就会提高。如果外源基因有毒性，在液体培养基和琼脂平板中加入,0.51%,葡萄糖以维持质粒稳定是非常必要的。当培养细胞到达稳定期时，葡萄糖会作为第一碳源首先被利用，而后才是甘油等碳源。替代碳源的代谢导致,lDE3,溶原菌中环,AMP(cAMP),水平提高，从而刺激,lacUV5,启动子指导的转录，,T7 RNA,聚合酶表达,。,例,1:,载体对表达的影响,pET32,BL21(DE3),表达的蛋白,:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD,),pET43,BL21(DE3),表达的蛋白,:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD,),诱导后,破菌上清,破菌沉淀,诱导前,诱导前,诱导后,破菌沉淀,破菌上清,破菌上清,例,2:,宿主菌对表达的影响,BL21(DE3),trx B,-,trx B,-,gor,-,Tissue plasminogen activator(tPA,9 disulfide bonds)was expressed in three different hosts.10 mg of soluble protein was spotted onto fibrin agarose plates and incubated for 24 h at 37C.Zone of clearing measures biological activity of tPA.,pET32,例,3:,表达条件对表达的影响,pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白,:His6-REIIBP(MW67KD,),0.1mM IPTG,incubate for 16h at 16,0.1mM IPTG,incubate for 3h at 37,N I S P,N I S P,U:Uninduced crude extract,I:Crude extract after induced,S:Lysis supertanant,P:Lysis precipitation,总结,任何一个达到特定目标的表达可以在,Vector,，,Strain,和,Growth Condition,三个水平进行调控；,许多时候为了达到高产量，高活性，易于下游纯化，在这三个水平上进行组合式摸索是很重要的；,一个难以纯化的蛋白很可能在上游得到很好的解决。,