双向凝胶电泳.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 双向凝胶电泳(2D-PAGE),蛋白质组分析的技术路线,双向凝胶电泳技术的发展及原理,仪器简介,样品制备,技术流程,1.蛋白质组分析的技术路线,要求,流程,技术路线,蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋,白,质,组,分,析,流,程,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,2.双向电泳技术的发展及原理,双向凝胶电泳的发展,双向凝胶电泳的基本原理,双向凝胶电泳的基本原理,先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。,第一向进行等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性,，,将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动,。,移动过程中,，,蛋白分子可能获得或失去质子,，,并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点,pH,区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动,。,同样,，,如果蛋白质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区域内。目前常使用预制胶条(,IPG,immobilized pH gradient)用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。,第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量(MW)大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。,IPG 胶的材料是 Immobilines，为拥有CH,2,=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合,，,在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用,，,因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,三种双向凝胶等电聚焦系统,根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：ISO-DALT、NEPHGE和IPG-DALT。,在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶(tube gel)中进行，载体两性电解质(carrier ampholyte)在外加电场的作用下形成pH梯度，pH梯度在碱性区不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低是其主要缺点，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质，其优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作，各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，目前唯一分辨到10000个蛋白质斑点的图谱正是采用了这一系统。,NEPHGE为非平衡pH梯度电泳,(nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是IPG(immobilized pH gradient)胶发明前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电聚焦场中达到平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。,IPG-DALT的第一向电泳是采用1982年发明的IPG胶(Bjellqvist B,Ek K,Righetti PG,et al,.Isoelectric focusing in immobilized pH gradient:principle,methodology and some applications.J Biochem Biophys Methods,1982,6:317-339)，其pH梯度的形成依赖于不同pK值的一种合成的化合物immobiline，该化合物是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱减，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合，因此，IPG胶的pH梯度是稳定的，不依赖于外加电场，基本上克服了ISO-DALT的主要缺点，无论在重复性和上样量上均优于ISO-DALT。,非变性2D-PAGE,：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；,非变性/SDS-2D-PAGE,：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用。,非变性/还原/SDS-2D-PAGE,：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素+5%-ME+2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAGE电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。,变性2D-PAGE,：样品先用2%SDS+5%-ME+95变性5min,IEF在8M尿素+1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS+5%-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100KD的蛋白质点少于第三种方式。,双向电泳的分类,3.仪器简介,第一向：,采用珀耳帖温度控制聚焦平台；最大电压为10,000伏；有不同的电压上升方式；可分步进行时间或电压小时控制；重泡胀可采取整体的或独立的步骤；程序可时时控制；可同时聚焦24根7cm，12根17cm胶条；有三个预设程序的方法；有十个用户自定方法；采集运行数据可经RS232端口输出或任何热敏打印纸。,BIO-RAD公司PROTEAN IEF Cell 等电聚焦仪：,Amersham pharmcia Biotech公司IPGphor等电聚焦仪：,电极区域为铜镀金板,；,最多上12个样品,；,平台温度为18-25,1,；,胶条槽(Holder)体为氧化铝陶瓷，丙烯酸的盖子；适合7、11、13和18cm的胶条,；,程序参数包括重泡胀时间,、,平台温度,、,每根胶条的最大限流,、,每步的电压,、,每步的电流改变模式,、,每步的时间,；,可编辑10个程序,，,每个程序分有九个步骤,；,电压输出最大为8000V,；,最大电流为1.5mA,；,最大功率为12W,。,第二向：,BIO-RAD公司PROTEAN II xi Cell电泳槽：,电极是直径为0.01英寸的白金电极；适用于16.520cm 凝胶电泳；凝胶厚度为1.0mm；可同时运行1-2块胶；上槽缓冲溶液350ml，下槽缓冲溶液1.2 L；典型SDS-PAGE电泳时间：无冷却时为5小时，带冷却时为3.5小时。配套电源为Power Pac 1000：在进行电泳时，最大电压不超过1000V，最大功率不超过80W，最大室温不超过50。,Amersham pharmcia Biotech公司Ettan DALT II System：,(1)此系统的电源控制为Power Supply/Control Unit：最大输出功率是200W；温度控制范围是10-50最大电压600V；最大电流1A。(2)使用Gel caster灌胶模具：最多可同时灌25.520.5cm、1mm厚的梯度胶或均一胶14块。,Amersham pharmcia Biotech公司Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit：,胶大小为10.08cm;最多可同时跑两块胶；跑一块胶时需1.7L电极缓冲液,，,跑两块胶时需1.2L电极缓冲液,；,最大电压是600V,，,最大功率是25W,；,所配置电源为Electrophoresis Power Supply EPS 301。,图像分析软件：,Amersham pharmcia Biotech公司：,imageMasterTM 2D version:5.0,BIO-RAD公司：,PDQuesTM,4.双向电泳分析中的样品制备,应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。,防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。,防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。,完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,样品的分级处理,通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。,样品的溶解,是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。,1、,样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；,2、,溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；,3、,溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,溶解的目标：,增加样品溶解性的手段,变性剂：,通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。,表面活性剂：,经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS,、,OBG等,。,其中CHAPS和SB3-10最好,。,还原剂：,在变性剂和表面活性剂联用条件下，加还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,，,溶解更彻底,。,常用含自由巯基的DTT或,-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原。,起载体作用的两性电解质：,即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2(w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。,样品中核酸的去除,对电泳的影响：,增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。,解决方法：,用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质(SCA)同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,亚蛋白质组样品的制备,用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。,第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；,第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；,第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。,顺序抽提法：,根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：,尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：,先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3-12、4-12或10-12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12)的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12)等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。,极端分子量的蛋白质：,小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,5.双向凝胶电泳技术流程,IPG重泡涨及样品加样,第一向等电聚焦,第二向SDS-PAGE,检测,问题及解决办法,IPG胶条的重泡胀,重泡涨时间至少要10h,，,泡涨不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收,。,重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，操作时需参照相关说明书。,不同的,加样方法和加样量,会导致最终结果的差异。,温度的选择：重泡涨及等电聚焦时温度一般稳定在20，太低尿素会结晶出来，温度不稳也会造成胶上的蛋白质点位置的变化。,重泡涨时加上30-50V的低电压会促进胶条对蛋白质的吸收，但这一点在制备型电泳时才有意义。,商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。重泡涨液的成分是：8mol/L Urea,2%CHAPS,18mmol/L DTT,0.5%IPG Buffer,痕量Bromophenol Blue，和裂解液成分基本相同，在10-100mmol/L浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度。,重泡涨可在等电聚焦盘内进行，此时样品已经加到重泡涨液中，在加样杯上样(cup loading)方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。,泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。,加样,样品可以在重泡涨时加入，称为胶内重泡涨(in-gel rehydration)，也可以重泡涨完成后再加入，如加样杯上样。重泡加样相对不可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和样品的界面产生沉淀，然而在某些特殊情况下，重泡涨后加样具有优势,，,如使用 pH,6-9,的胶条分离碱性蛋白质时，在阳极用加样杯加样，可以得到更好的图谱。一般而言，胶内重泡涨是推荐方式，可以增加蛋白质的上样量，也避免了在阴极或阳极加样的方向问题。,分析型双向凝胶电泳上样量在几十至几百微克之间，制备型双向凝胶电泳上样量在数百（银染）到最大几十毫克（考马斯亮蓝染色）之间，上样量的大小和胶条的pH范围也有关系，pH 范围越窄，上样量月大。但由于蛋白质定量方法的重复性并不十分可靠，最佳的上样量要根据实验结果来优化。,蛋白载样量,影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：,待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。,电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。,待研究蛋白的丰度：,样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。,IPG胶条的pH范围：,IPG胶条的蛋白质大约载样量,IPG Strip length,Analytical Load,(silver staining),Preparative Load,(Coom staining),7cm,10100,g/125,l,200500ug/125,l,11cm,50200,g/185,l,2501000ug/185,l,17cm,100300,g/300,l,13mg/300,l,IPG IEF 中 pH梯度的选择,常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。,预分步收集,细胞浆,细胞核,细胞膜,核糖体及其他特定细胞成份,细胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH 3-4,pH 4-5,pH 5-6,pH 6-7,pH 7-8,pH 8-9,pH 9-10,pH 10-11,pH 11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白,阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质,亚蛋白质组阵列策略的框架图,3倍,3倍,聚焦时间的优化,重泡涨结束后，在胶条和电极之间加上润湿的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分。在阴极加上20mmol/L DTT润湿的纸片可减少碱性端的水平条纹并且有助于碱性蛋白质的聚焦。,从理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。,聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。,过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。,最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。,等电聚焦的电压上升分为三个阶段首先加上一个比较低的电压，去出胶条中的过多的盐离子；然后开始加高电压，电压上升的模式为缓慢上升；最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。一般原则是：根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定的范围内调整。,IEF的基本条件,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,两维间的平衡,一维（等点聚焦）电泳结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。,但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE 时电泳能顺利进行。,建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6 mM尿素和30%甘油的50mM Tris(pH8.8)缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15 min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。,二维 SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE类似。,但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，可以把 IPG 胶条看作是压缩胶，因为在 IPG 胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性 IEF 胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶，所以只需使用分离胶（也可使用压缩胶）。,IPG 胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲夜里浸一下，这样一方面可以清洗胶条去除胶条上的平衡液，另一方面，润湿的胶条也容易沿着玻璃板推到SDS-PAGE胶上端。,IPG胶条转移到SDS-PAGE有两种方式：一种方式是先将IPG胶条放到SDS-PAGE胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液；另一种方式是先加入熔化的琼脂糖溶液，再将 IPG 胶条放到,SDS-PAGE,胶 上。两种方法各有优劣，第一种方式图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡发生，第二种方式非常好地解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入,IPG,胶时有时会造成图谱变形。相比较之下，气泡对图谱的影响较小，故常推荐第一种方式。,SDS-PAGE胶的浓度需根据研究目的和样品性质而定。常用的是12%和12.5%的均一胶，灌胶方便，重复性好，但相对分子质量较高的蛋白质斑点较为聚集，分离不佳。如采用9-16%的线性梯度胶，相对分子质量不同的蛋白质点在整块凝胶上分布比较均匀，但灌胶不易。,电泳过程中温度一般控制在10-15。,聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测,理想显色剂的7S,安全 (safety)；,灵敏 (sensitivity)；,简单 (simplicity)；,特异性(specificity)；,快速 (speed)；,稳定 (stability)；,兼容性(synergy)。,有机染料和银染,考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。,胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。,胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。,银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。,这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。,负 染,能专门提高 PAGE 胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。,结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。,速度快(515min)，蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如 EDTA 或 Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。,它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。,该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。,胶体扩散染料,主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。,最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。,这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。,有机荧光团染料,包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。,这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。,这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。,在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。,金属螯合染料,这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台(包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等)相结合。,其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料,。,凝胶的图像处理和分析,典型流程：,凝胶图像的扫描；,图像加工；,斑点检测和定量；,凝胶配比；,数据分析；,数据呈递和解释；,2-DE数据库的建立。,2D-PAGE问题与原因第一向等电聚焦的问题,问题与现象,可能原因与解决措施,IPG胶条在靠近电极附近烧焦,电流限制太高，最大电流限制设为50A；,IPG胶条没有完全重泡涨；,应检查重泡涨液的体积，保证重泡涨液的体积足够；,IPG胶条过于干燥；重泡涨和等电聚焦时加矿物油。,电压太低，达不到最高电压,样品盐浓度太高；,脱盐或稀释样品，等电聚焦12h后更换电极电片；,盐浓度不得超过100mmol/L，最好控制在10mmol/L以内；,等电聚焦的设置错误；,检查电压设置。,电流为零或很低,持胶槽和电极接触不好，或者电极和胶条的接触不好；,检查以上接触情况，检查胶条是否重泡涨。,尿素在胶条表面结晶,温度太低；,温度控制设为20，室温不能太低。,2D-PAGE问题与原因第二向 SDS-PAGE（垂直系统）的问题,问题与现象,可能原因与解决措施,开始时没有电流,上下槽是否有电泳缓冲液。,电泳太慢,检查电泳缓冲液是否配错；,检查分离胶缓冲液是否配错。,溴酚蓝前沿一边上翘,阴极电泳缓冲液没有接触胶的一端；,保证电泳缓冲液覆盖了胶的全长。,溴酚蓝前沿两边上翘,冷凝不好，检查冷凝器是否工作正常。,溴酚蓝前沿不规则,受IPG buffer影响，对最终的结果没有影响；,胶条太旧或二向成品胶太旧，检查日期是否过期；,IPG胶条转移到二向时下面有气泡；,保证胶条和二向胶顶部紧密接触，无气泡。,2D-PAGE问题与原因 染色的问题,问题与现象,可能原因与解决措施,水平条纹,聚焦时间太短(尤其对于相对分子质量较高的蛋白质)或太长(蛋白质会分解)；,优化聚焦时间,去垢剂浓度太低或使用了不合适的去垢剂；,检查去垢剂浓度,测试不同的去垢剂,尿素浓度太低；,重泡涨液的浓度不低于8mol/L,IPG胶条时间太短，没有重泡涨到其原始厚度；,重泡涨胶条至0.5mm厚，时间大于6h或过夜,裂解液或重泡涨液的DTT浓度不够；,裂解液的DTT浓度为65mmol/L或重泡涨液的DTT浓度为18mmol/L,单个蛋白质的多重氧化；,加足够量DTT，等电聚焦时加上矿物油，矿物油脱气或充上惰性气体,由于DTT朝阳极移动，碱性端DTT消耗；,在阴极加上20mmol/L DTT润湿的电极垫片,错误的电极加样区域；,检查阳极还是阴极加样比较好，或者使用样品的胶内重泡涨方式加样,由于样品的内源性水解造成的假象；,用TCA丙酮法处理失活蛋白酶，加入蛋白酶抑制剂或与SDS一起煮,空气中的CO,2,干扰；,等电聚焦时加矿物油，密封电泳腔或在腔内加上NaOH润湿的纸片去除CO,2,相对分子质量为68000或55000的条纹，可能有角蛋白或白蛋白污染，或者由巯基乙醇造成；,过滤所有溶液，用DTT取代巯基乙醇,蛋白质加样处产生沉淀；,等电聚焦时采用低电压,蛋白质抽提时有不溶物在样品中；,高速离心40000g 1h,垂直条纹,蛋白质从一向转移到二向时发生沉淀；,提高平衡的SDS浓度，适当延长平衡时间,蛋白质上样量过大；,降低上样量,水不够纯净，SDS-PAGE胶配制时没有过滤(背景有极细的条纹)或者胶条平衡后仍带有额外的DTT；,使用Millipore水，过滤胶液。使用IAA平衡IPG胶条，去除额外的DTT,成对的竖直条纹遍布于胶上；,可能是有硫脲引起的，原因尚不明,Thanks!,