第05章-代谢物酶法分析技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验,（第二版）,第五章代谢物酶法分析技术,第五章,代 谢 物 酶 法 分 析 技 术,江苏大学基础医学与医学技术学院,姜旭淦,全国高等医药院校医学检验专业规划教材,临床生物化学检验,（第二版）,代谢物酶法分析技术,：用,酶法分析,的方法来测定体內的,代谢物或代谢产物,的技术。,酶法分析,（,Enzymatic method,）：以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶（辅基）、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。,概 念,2,目录,代谢物酶法分析的理论基础,1,代谢物酶法分析的方法,2,代谢物酶法分析的设计要求,3,3,第一节,代谢物酶法分析的理论基础,代谢物酶法分析,平衡法（终点法）,速率法（动力学法）,4,平衡法,：标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（,1%,5%,）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法,(,end-point method,),。,平衡法的特点是测定待测物的总变化量，即测定的是“浓度”。,一、,平衡法基本理论,5,积分得,：,米氏方程,改写为,若反应达到平衡，假设,，即,S,0,S,t,S,0,，,则可简化为：,达到平衡所需的时间与,Km,、,Vmax,、,S,0,有关，,Km,越小、,Vmax,越大（加入酶量越多）、,S,0,越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。,6,若,S,0,Km,积分得：,可简化为：,若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（,t,）一致，则有：,7,标准,管的,S,0,S,t,与待测管的,S,0,S,t,分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（,As,和,Au,）。标准管的,S,0,与测定管的,S,0,分别表示为,Cs,和,Cu,。,当,S,0,S,t,S,0,，即反应基本达到平衡，,Au,和,As,基本稳定不变，此时测定误差最小。,如果存在基质,效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差。,8,速率法,(,rate assay,),又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度）。,依据,：当,底物的消耗量较小时,(,5%,),，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度,（,v,）,与代测物的浓度成正比例。,速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。,速率法基本理论,二、,9,根据米氏方程：,当,S,Km,，则,S,+Km Km,当酶量固定不变时，酶促反应的,最大速度,Vmax,也不变,符合一级酶促反应,米氏方程改为：,10,若同时带标准管,，则有,：,标准管的,S,0,与测定管的,S,0,分别表示为,Cs,和,Cu,，速度用,A/min,来表示。上式改写为：,速率法测定代谢物浓度的原理,在临床操作中，只要测定期间待测物消耗,Km2,，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。,以,NADH,或,NADPH,为底物的终点法测定中，因,340 nm,吸光度,的限制，辅酶的用量不可能过高。,16,第,17,页,脱氢酶法测定乳酸,根据乳酸在乳酸脱氢酶（,LD,）催化下脱氢生成丙酮酸，氧化型,NAD+,接受氢转变成还原型,NADH,。加入硫酸肼可捕获产物丙酮酸促成反应完成。生成的,NADH,与乳酸为等量摩尔，于,340nm,波长测定,NADH,的吸光度，可计算出血液中的乳酸含量。,17,第,18,页,脱氢酶法测定丙酮酸,是乳酸测定的逆反应，丙酮酸在,LD,的催化下，接受,NADH,递给的氢，还原为乳酸并生成,NAD+,。根据,NADH,吸光度的下降值可测定样品中的丙酮酸。,18,第,19,页,脱氢酶法测定血浆,羟丁酸,-,羟丁酸在,-,羟丁酸脱氢酶的催化下，被氧化生成乙酰乙酸，同时,NAD+,被还原为,NADH,，在,pH8.5,时测定,340nm,波长下,NADH,吸光度上升的速率，就可以计算出血浆中,-,羟丁酸的浓度。,19,酶偶联法,：酶促反应的底物或产物没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法。,最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。,酶偶联法,二、,20,（一）脱氢酶指示系统,辅酶,(,NAD,+,),或氧化型辅酶,(,NADP,+,),变为还原型,NAD(P)H,后，在,340 nm,处的吸光度增高来计算出被测物的浓度。,NAD,(,P,),H,变为氧化型,NAD,(,P,),+,，测定,340 nm,处吸光度的下降来计算被测物的浓度。,21,脱氢酶指示系统,血清葡萄糖己糖激酶法测定,Glu,+ATP,G-6-P+ADP,G-6-P+,NADP,+,P-6-G,A,+,NADPH+H,+,指示酶反应将,NADP,+,转化为,NADPH+H,+,，测定,340 nm,吸光度上升的,速度与葡萄糖的含量成正比,22,脱氢酶指示系统,血清尿素测定,尿素,+H,2,O,2NH,3,+CO,2,NH,3,+-,酮戊二酸,+NADH+H,+,谷氨酸,+H,2,O+NAD,+,测定,340nm,吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定。,23,但该法存在内源性氨和外源性氨，以及内源性脱氢酶和还原型辅酶的干扰，需采用含,LD,抑制剂（如高浓度丙酮酸）的双试剂法来测定，否则测定结果偏高。,第,24,页,酶偶联脱氢酶法测定,尿素方法性能评价,尿素酶偶联脱氢酶法测定血清尿素方法简便、快速，适用于临床常规分析,24,第,25,页,脱氢酶法测定肌酐,肌酐在肌酐亚氨基水解酶,(CRDI),的作用下水解为,N-,甲基,-,乙内酰脲和,NH4+,，,NH4+,与,NADPH,和,-,酮戊二酸在,GLDH,的作用下，生成,L-,谷氨酸和,NADP+,，记录,340 nm,处吸光度的下降，进而计算出标本中肌酐的浓度。,25,第,26,页,该方法的主要缺点是试剂不够稳定，且肌酐酶来源困难，使得试剂盒价格昂贵，影响其在临床实验室的普遍使用。,肌酐脱氢酶法与参考方法高效液相色谱法具有良好的相关性，精密度好、准确度高、线性范围宽，不受黄疸、乳糜血、溶血和临床常用治疗药物及体内代谢物的干扰，结果更趋于真值，易于自动化分析，可用于血液及尿液的检测。,肌酐脱氢酶法性能评价,相比之下，肌氨酸氧化酶法具有灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好等优点。,26,第,27,页,酶法测定血浆碳酸氢根,血浆中的,HCO,3,-,在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（,PEPC,）催化下，与磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸和苹果酸脱氢酶（,MDH,）反应，生成苹果酸，同时将,NADH,氧化成,NAD,+,；在,340nm,波长处吸光度的降低与样品中,HCO,3,-,含量成正比。,27,（二）过氧化物酶指示系统,共用的指示反应最早由,Trinder,等人提出，被称为,Trinder,反应,。,广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定,28,化学名,英文缩写,最大吸收峰（,nm,）,酚,2,，,4-,二氯酚,N-,乙基,-N-,（,3-,甲苯）,-N-,乙酰乙二胺,N-,乙基,-N-,（,2-,羟基,-3-,丙磺酰）间甲苯胺,N-,乙基,-N-,（,3-,丙磺酰）,-3,，,5,二甲氧基苯胺,P,2,，,4-DCP,EMAE,TOOS,ESPDMA,500,510,555,555,585,过氧化物酶指示系统,常用的,Trinder,反应生色基团,29,第,30,页,1.,葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖,根据,GOD,可以高特异性的催化葡萄糖氧化成为葡萄糖酸并同时产生,H,2,O,2,，生成的,H,2,O,2,参与,Trinder,反应，生成醌亚胺色素，在,505nm,波长下比色检测，生成的吸光度与葡萄糖浓度成正比。,30,第,31,页,2.,酮胺氧化酶法测定糖化血清蛋白,GSP,在蛋白酶,K,的作用下可形成糖化蛋白片段，该片段在,KAO,的作用下分解为氨基酸、葡萄糖和,H,2,O,2,，生成的,H2O2,即可用,Trinder,反应测定。,31,第,32,页,3.,甘油磷酸氧化酶法测定血清三酰甘油,血清,TG,可被,LPL,水解为甘油和脂肪酸，生成的甘油被甘油激酶（,GK,）及,ATP,磷酸化后形成,3-,磷酸甘油，磷酸甘油氧化酶（,GPO,）氧化,3-,磷酸甘油产生,H,2,O,2,，生成的,H,2,O,2,参与,Trinder,反应而被测定。,32,4.,血清总胆固醇氧化酶测定法,胆固醇酯,+H,2,O,胆固醇,+O,2,胆固醇,+,脂肪酸,4,-,胆甾烯酮,+H,2,O,2,红色醌类化合物,H,2,O,2,+4-AAP+,酚,指示酶反应生成的红色醌类,化合物可在,500 nm,处比色测定,33,第,34,页,5.,匀相法测定,HDL-C,利用一系列反应先将,CM,、,VLDL,、,LDL,或其反应产物清除，然后加入一种特殊的选择性表面活性剂，使,HDL,颗粒形成可溶状态，其释放的胆固醇和胆固醇酯与,CEH,及,COD,反应，生成的,H,2,O,2,用,Trinder,反应测定。,34,利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增。,当待测物浓度很低时，指示反应可检测信号很小。利用酶促反应，使待测物和终产物之间的部分反应能循环进行，使检测信号不断增加。,酶循环法,三、,35,使用两种酶，一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质（或其衍生物）或靶物质的氧化产物作为底物循环。,（一）产物循环,-,氧化酶脱氢酶系统,A B C,Ea,Ea,Ei,36,产物循环,-,氧化酶脱氢酶系统,甘油浓度测定,检测指示系统：,循环前、后用速率法测定,NADH,(,340 nm,),的变化。,检测产物,H,2,O,2,可通过,Trinder,反应比色测定。,37,（二）底物循环,A B C,Ea1,Ea2,Ei,A B,Ei,Ea(i,),D,Ea3,A B C,Ea1,Ei,38,（二）底物循环,1.,脱氢酶辅酶系统,用一种脱氢酶和两种辅酶,（,thio,-NAD,+,和,NADH,）。用,395,nm,415 nm,波长测定反应中氧化型,thio,-NAD,+,转为还原型,thio,-NADH,的增加,速度。,39,血淸胆汁酸测定,胆汁酸与,3-,酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶,（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。,40,2.,转移酶,-,水解酶系统,同型半胱氨酸酶法测定,腺苷,S-,腺苷同型半胱氨酸,次黄苷,41,3.,合成酶脱氢酶系统,-,氨的测定,NH,4,+,在,NAD,合成酶和,Mg,2+,存在下催化脱氨,-NAD,转化为,NAD,+,，经亮氨酸脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和,NH,4,+,同时生成,NADH,，生成的,NH,4,+,进入循环再次生成,NADH,，在,340nm,测定。,42,很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去或降低其催化活性。,无活性或低活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶复活或激活，,复活,或激活,的比例可反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量,。,激活剂和抑制剂法,四、,根据有抑制剂存在时，酶促反应动力学发生改变来测定抑制剂的含量。,43,激活剂与酶结合后恢复酶的催化活性,44,抑制剂与酶结合后抑制酶的催化活性,45,第,46,页,无机离子测定：,（一）丙酮酸激酶法测定钾离子,（二）,-,半乳糖苷酶法测定钠离子,（三）淀粉酶法测定氯离子,（四）异柠檬酸脱氢酶法测定镁离子,1,酶激活和酶抑制,测定法,微量元素测定：,（一）超氧化物歧化酶法测定铜离子,（二）碳酸酐酶法测定锌离子,有机磷测定,46,1.,异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子,异柠檬酸,+NADP,+,-,酮成二酸,+CO,2,+NADPH+H,+,用,EDTA,和乙二醇二乙醚二胺四乙酸,(,GEDTA,),抑制钙离子，标本中,Mg,2+,通过恢复,ICD,活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使,NADP,+,还原。,47,2.,葡萄糖激酶法测定血清镁,48,3.Na,+,的酶法测定,Na,+,激活,-,半乳糖苷酶水解邻硝基酚,-D-,半乳糖苷,（,ONPG,）,，产生在,420nm,波长有特征吸收光谱的产物邻,-,硝基酚。邻,-,硝基酚产生的速率与,Na,+,离子浓度呈正比。,49,4.,丙酮酸激酶法测定血清钾,反应中,NADH,的消耗量与血清中钾离子浓度呈正比。通过在,340nm,处监测吸光度下降速率，即可以计算钾离子含量。,50,5.,氯离子测定,51,第,52,页,第,52,页,第,52,页,第,52,页,第,52,页,6.,超氧化物歧化酶法测定铜离子,黄嘌呤（,xanthine,）在黄嘌呤氧化酶（,XO,）的作用下可以生成,O,2,-,，该物质可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在,560nm,处有强吸收，而,SOD,可清除,O,2,-,，从而抑制了甲臜（,NBT,Formazan,）的形成。反应液的颜色（蓝色）越深，说明,SOD,活性愈低，间接的反映血清中,Cu,2,+,离子的浓度，吸光度与浓度成反比。,52,第,53,页,第,53,页,第,53,页,第,53,页,第,53,页,第,53,页,7.,碳酸酐酶法测定锌离子,将标本加入试剂中，标本中的锌即与无活性的碳酸酐酶结合，形成有活性的碳酸酐酶，催化醋酸对硝基酚生成黄色的对硝基酚，在,405nm,附近有吸收峰。在一定反应时间内，生成的对硝基酚吸光度变化速率大小与锌浓度成正比。,53,第,54,页,8.,酶抑制剂法测定有机磷,乙酰胆碱酯酶催化底物水解生成乙酸和胆碱，后者与,5,5-,二硫代,-,双,-2-,硝基苯甲酸反应，生成黄色产物,5-,硫代,-2-,硝基苯甲酸，它在,410nm,处有最大吸收，测定它在单位时间内的生成量，即可测得乙酰胆碱酶的活性。当待物中含有机磷时反应受到抑制，乙酰胆碱酯酶活性降低，吸光度与有机磷浓度成反比。,54,试剂酶质量要求,试剂酶概念,试剂酶特征,试剂酶纯度,酶法设计要求,酶法设计共性要求,平衡法设计的要求,速率法设计的要求,代谢物酶法分析的设计要求,第三节,试剂酶来源,55,试剂酶,：作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。,试剂酶的质量要求,一、,（一）试剂酶的概念,56,主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用。,不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、,Km,、最适,pH,，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。,（二）试剂酶的来源和理化特征,57,不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以,NAD,（,P,）,H,为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在,Trinder,反应中要求相对低一些。,纯度主要指标,：,酶的,比活性,，酶的比活性越高，酶的纯度越高。,杂酶含量。,（三）试剂酶的纯度要求,58,所用试剂酶的特异性,：指示酶要有更高特异性；,消除干扰因素,：加消除剂、抑制剂和用双试剂法；,试剂中的附加剂,：应不抑制酶的活性，不影响试剂的稳定性，不与底物和体液中的物质作用；,如何提高灵敏度,：酶循环法；荧光法。,酶法分析的设计要求,二、,（一）酶法设计的共性要求,59,酶的用量要足够大，能使反应,1 min,3 min,达到平衡，以保证较快完成测定。,反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应,pH,等方法，并设标准管一起到达平衡以后测定。,Km,在保证测定线性的前提下要尽量小。,（二）平衡法设计的要求,60,所用酶的,Km,应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。,Km,太小，可加入竞争性抑制剂加大,Km,。,酶用量要合适，用多了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般酶用量比平衡法小。,速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（,v,）才与代测物的浓度成正比例。,（三）速率法设计的要求,61,区别,速率法,平衡法,测定时间,检测速度,检测成本,产物堆积,样品色原,测定仪器,较,短,较,快,酶用量小，成本低,影响较小,影响较小,要求电噪声小，,A,读准到,0.0001,，温差,0.1%,较长,较,慢,酶用量大，成本,高,影响较大,影响较大,要求不严,速率法和平衡法测定比较,Km,、代谢物转化率 。,62,第五章 代谢物酶法分析技术,1.,简述代谢物酶法分析主要优点？,2.,何谓平衡法和速率法？从检测原理上比较相互联系与区别。,3.,简述代谢物酶法分析的类型，并举例说明。,4.,何谓酶循环法？举例说明其临床应用。,5.,何谓酶活性恢复法？举例说明其临床应用。,6.,何谓试剂酶？衡量其纯度的主要指标有哪些？,7.,简述平衡法和速率法设计的基本要求。,63,谢谢！,64,