3.紫外可见分光光度法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3-1,基本原理,3-2 Lambert-Beer,定律,3-3,显色反应及其显色条件,3-3,紫外,-,可见分光光度计,3-4,分析方法,第,3,章 紫外,-,可见分光光度法,(Ultraviolet and Visible,Spectrophotometry,UV-Vis),UV-Vis,是基于被测物质的,分子,对,光（,200800nm,）,具有选择吸收的特性而建立的分析方法。,射线,x,射线,紫外光,红外光,微波,无线电波,10,-2,nm 10 nm 10,2,nm 10,4,nm 0.1 cm 10cm 10,3,cm 10,5,cm,可 见 光,UV-Vis,方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射的吸收特性。,UV-Vis,涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在,160780nm.,UV-Vis,主要用于物质的定量分析，但紫外光谱,(UV),为四大波谱之一，是鉴定许多化合物，尤其是有机化合物的重要定性工具之一。,/nm,颜色,互补光,400-450,紫,黄绿,450-480,蓝,黄,480-490,绿蓝,橙,490-500,蓝绿,红,500-560,绿,红紫,560-580,黄绿,紫,580-610,黄,蓝,610-650,橙,绿蓝,650-760,红,蓝绿,可见光,单色光、复合光、光的互补,单色光,复合光,光的,互补,单一波长的光,由,不同波长的光组合而成的光,若,两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,蓝,黄,紫红,绿,紫,黄绿,绿蓝,橙,红,蓝绿,物质对光的吸收,物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,1.,过程：运动的分子外层电子,-,吸收外来辐射,-,产生电子能级跃迁,-,分子吸收光谱。,2.,能级组成：,3-1,基本原理,一、分子吸收光谱的产生,物质分子,内部,三种运动形式：,（,1,）电子相对于原子核的运动；,（,2,）原子核在其平衡位置附近的相对振动；,（,3,）分子本身绕其重心的转动。,三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。,分子的能量变化,E,为各种形式能量变化的总和：,其中,E,e,最大：,1-20,eV,;,（紫外,-,可见）,E,v,次之：,0.05-1,eV,;,（红外）,E,r,最小：,0.05,eV,。（远红外）,可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大,12,个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振,-,转能级的跃迁，形成所谓的,带状光谱,。,E,e,E,v,E,r,3.,吸收光谱,纯,电子能态,间跃迁,S,2,S,1,S,0,S,3,h,E,2,E,0,E,1,E,3,S,2,S,1,S,0,h,A,h,h,h,分子内电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,A,不同物质结构不同或者说其分子能级的能量,(,各种能级能量总和,),或能量间隔各异，因此不同物质将,选择性,地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是,UV-Vis,定性分析的基础。,物质对光的选择吸收,物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。,例：,A,物质,B,物质,同理，得：,1,eV,=1.6,10,-19,J.,测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（,）,为横坐标，吸光度（,A,）,为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。,(a),(b),(c),(d),220 240 260 280,nm,A,0,0,0,0,(a),联苯（己烷溶剂）；,一些典型的紫外光谱,(b),苯（己烷溶剂）；,(c),苯,蒸汽；,(d)Na,蒸汽。,吸收光谱的获得,电子,-,振动,-,转动光谱,-,胡罗卜素,咖啡因,阿斯匹林,丙酮,几种有机化合物的分子吸收光谱图。,据吸收曲线的特性,(,峰强度、位置及数目等,),研究分子结构。,分子吸收光谱上可以看到哪些特征呢？,吸收谷：吸收曲线上的谷称为吸收谷，所对应的波长称为最小吸收波长（,min,）。,末端吸收：在吸收曲线的,200nm,波长附近,吸收峰：吸收曲线上的峰称为吸收峰，所对应的波长称为最大吸收波长（,max,）。,肩峰：吸收峰上的曲折处称为肩峰,(shoulder peak),，通常用,sh,表示。,吸收曲线的讨论：,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。,不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似,max,不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和,max,则不同。,吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,A,B,A,讨论：,不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度,A,有差异，在,max,处吸光度,A,的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。,在,max,处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,A,C,增大,有机分子能级跃迁,跃迁类型,有机分子包括,:,成键轨道,、,；,反键轨道,*,、,*,非键轨道,n,C,H,H,O,o,o,o,o,=,=,o=,n,二、分子吸收光谱跃迁类型,分子基态的电子组态,1,、用原子轨道线性组合法产生出各个分子轨道；,2,、把电子加到每个分子轨道中去，在每个分子轨道中最多加进两个电子（,Pauli,原理），由此产生分子的电子组态；,3,、把电子对加到最低能量轨道中去（建造原理），从而产生最低能量的电子组态（基态电子组态）,例：甲醛的分子轨道,电子基态,C =O,H,H,：,A,原子轨道,B,原子轨道,*,A,原子轨道,B,原子轨道,*,电子跃迁与电子激发态,甲醛的电子基态,S,2,S,1,S,0,T,2,T,1,电子跃迁类型,最低激发态和基态的,电子组态,最低激发态和基态的,电子态,电子多重态,各轨道能级高低顺序：,n,*,*,；,可能的跃迁类型：,-,*,；,-,*,；,-,*,；,n-,*,；,-,*,；,n-,*,-,*,:C-H,共价键,如,CH,4,(125nm)C-C,键,如,C,2,H,6,(135nm),处于真空紫外区。,-,*,和,-,*,:,尽管所需能量比上述,-,*,跃迁能量小,但波长仍处于真空紫外区；,n-,*,:,含有孤对电子的分子,如,H,2,O(167nm),CH,3,OH(184nm),CH,3,Cl(173nm),CH,3,I(258nm),(CH,3,),2,S(229nm),(CH,3,),2,O(184nm),CH,3,NH,2,(215nm),(CH,3,),3,N(227nm),可见,大多数波长仍小于,200nm,，,处于远紫外区。,以上四种跃迁都与,成键和反键轨道有关,(,-,*,，,-,*,，,-,*,和,n-,*,),跃迁能量较高，这些跃迁,所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。,只有,-,*,和,n-,*,两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。,无机物分子能级跃迁 （了解）,一些无机物也产生紫外,-,可见吸收光谱，其跃迁类型,包括,p-d,跃迁或称电荷转移跃迁以及,d-d,f-f,跃迁或称,配场跃迁。,1.,电荷转移跃迁,一些同时具有电子予体,(,配位体,),和受体,(,金属离子,),的无机分子，在吸收外来辐射时，电子从予体跃迁至受体所产生的光谱。,max,较大,(10,4,以上,),，可用于定量分析。,2.,配场跃迁,过渡元素的,d,或,f,轨道为简并轨道，当与配位体配合时，轨道简并解除，,d,或,f,轨道发生能级分裂，如果轨道未充满，则低能量轨道上的电子吸收外来能量时，将会跃迁到高能量的,d,或,f,轨道，从而产生吸收光谱。,吸收系数,max,较小,(10,2,),，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。,无配场,八面体场,四面体场,平面四面形场,d,轨道电子云分布及在配场下的分裂示意图,小结,饱和有机化合物无,UV-Vis,；,电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切关系,分子结构,电子跃迁类型,max,和电子跃迁类型,基团（结构鉴定）,根据,生色团,（,Chromogenesis,group,）：,分子中含有非键或,键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起,n-,*,和,-,*,跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。,助色团,（,Auxochromous,group,）：,含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。,红移,或,蓝移,（,Redshift,or,blueshift,）：,在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向（,红移,）或短波方向移动（,蓝移,）的现象。,那么促使分子发生红移或蓝移的因素有哪些呢,？,三、常用术语,四、吸收带,（一）吸收带,1,R,带：由含,杂原子,的不饱和基团的,n,*,跃迁产生,C,O,；,C,N,；,N,N,E,小，,max,250400nm,，,max,200nm,，,max,10,4,共轭体系增长，,max,红移，,max,增大,s,p,*,s,*,R,K,E,B,n,p,E,3,B,带：由,*,跃迁产生,芳香族,化合物的主要特征吸收带,max,=256nm,，,宽带，具有精细结构；,max,=200,4,E,带：由,苯环环形共轭系统,的,*,跃迁产生,芳香族化合物的特征吸收带,E,1,180nm,max,10,4,（,常观察,不到）,E,2,200nm,max,=7000,强吸收,苯环有发色团取代且与苯环共轭时，,E,2,带与,K,带合并一起红移（长移）,为什么同一种吸收带（不同化合物中的）形状、位置、强度不同呢,？,（二）影响吸收带的主要因素,影响吸收带形状（位置）的因素有：,被测化合物的结构,测定的状态,测定的温度,溶剂的极性,。,影响吸收带强度的因素有：,能级差,因素：能级差小，跃迁几率大；,空间位置,因素：处在相同的空间区域跃迁几率大。,内因：,1.,共轭效应的影响,(1),电子共轭体系增大，,max,红移，,max,增大,165,nm,217,nm,（,3,）,位阻效应,顺反异构造成的立体障碍,顺式二苯乙烯,max,208 nm,反式二苯乙烯,max,295.5nm,（,2,）超共轭效应,两个发色团产生共轭，可使吸收带长移。若立体障碍妨碍他们处于同一平面上，就会影响共轭效应。,烷基（,-R,）与共轭体系相连时，,max,红,移，,空间阻碍使共轭体系破坏，,max,蓝,移，,max,减小。,-,重叠,（,4,）跨环效应,有些,，,不饱和酮中，虽然双键与酮基不产生,共轭，但由于适当的立体排列，使羰基氧的孤对,电子和双键的,电子发生作用，以致相当于,n,*,的,R,带,红,移，吸收增强。,max,=284nm,当,C=O,的,轨道与一个杂原子的,P,轨道有效交盖时，也会出现跨环效应。,max,=238nm,2.,取代基的影响,在光的作用下，有机化合物都有发生极化的趋向，即能转变为激发态。当共轭双键的两端有容易使电子流动的基团,(,给电子基或吸电子基,),时，极化现象显著增加。,（,1,）给电子基：,带有未共用电子对的原子的基团，如,-NH,2,-OH,等。未共用电子对的流动性很大，能够形成,p-,共轭，降低能量，,max,红移。,给电子基的,给电子能力顺序,为：,-N(C,2,H,5,),2,-N(CH,3,),2,-NH,2,-OH-OCH,3,-NHCOCH,3,-OCOCH,3,-CH,2,CH,2,COOH-H,（,2,）,吸电子基：,易吸引电子而使电子容易流动的基团，如：,-NO,2,-CO,-CNH,等。共轭体系中引入吸电子基团，也产生,电子的永久性转移，,max,红移。,电子流动性增加，吸收强度增加。,吸电子基的作用,强度顺序,是：,-N,+,(CH,3,),3,-NO,2,-SO,3,H-COH-COO,-,-COOH-COOCH,3,-,Cl,-Br-I,（,3,）,给电子基与吸电子基同时存在：,产生分子内电荷转移吸收，,max,红移，,max,增加。,表,3-5,外因,3.,溶剂效应,溶剂极性的影响,：,极性增大：,n,*,跃迁产生的吸收峰,短,移,*,跃迁产生的吸收峰,长,移,例：溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁的影响,跃迁类型,正己烷,氯仿,甲醇,水,迁移,*,230nm,238nm,237nm,243nm,长,移,n,*,329nm,315nm,309nm,305nm,短,移,非极性溶剂中,极性溶剂中,非极性溶剂中,极性溶剂中,n,*,*,溶剂极性对两种跃迁的影响,E,非,E,极,E,非,E,极,n *,跃迁,*,跃迁,例如苯胺在酸性环境形成阳离子,n,电子消失，氨基的助色作用消失；苯酚在碱性环境形成阴离子,呈现,n,电子。,4,、体系,pH,的影响,氢键的影响,max,210.5nm,，,270nm,max,236nm,，,287nm,max,6200 1450,max,9400 2600,max,230nm,，,280nm,max,203nm,，,254nm,max,8600 1470,max,7500 160,3-2,Lambert-Beer,定律,I,0,=,I,a,+I,t,+,I,r,+,I,s,因此，在样品测量时必须同时采用,参比池,扣除这些影响,！,一、几个术语,I,0,I,r,I,t,Transmittance T Absorbance A,0.575,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I,0,I,t,参比,样品,未考虑吸收池和溶剂对光子的作用,注意比较,吸光度的测量方式,相对测量法,二、,Lambert-Beer,定律,1.,朗伯定律,A=,K,1,b,2.,比耳定律,A=,K,2,c,3.,朗伯,-,比耳定律,如果同时考虑溶液的浓度和液层的厚度都变化，都影响物质对光的吸收，则上述两个定律可合并为,此式为光吸收定律的数学表达式。,推导,s,i,是第,i,种吸光分子对指定频率光子的吸收截面；,d,n,i,是第,i,种吸光分子的数目；,m,是能吸光的分子的种类数。,n,i,是总的吸光数目；,V,代表体积；,N,A,是阿佛加得罗常数；,a,i,是第,i,种吸光物质的吸收系数；,b,是液层厚度（即光程长度）；,c,i,是浓度。,讨论：,1,Lamber,-Beer,定律的适用条件（前提）,入射光为单色光,溶液是稀溶液,2,该定律适用于固体、液体和气体样品（均匀,介质）,3,在同一波长下，各组分吸光度具有加和性,应用：多组分测定,吸光系数,Absorptivity,b,吸光液层的厚度，光程，,cm,c,吸光物质的浓度,g/L,mol/L,K,比例常数,入射光波长,物质的性质,温度,取值与浓度的单位相关,c,：,mol/L,K,摩尔吸光系数，,L,mol,1,cm,-1,c,：,g/L,K,a,吸光系数，,L,g,1,cm,-1,c,：,g/100,mL,K,比,吸光系数,相互关系,例：氯霉素吸光系数的测定,称取该物质的纯品配制成,100ml,含,2.00mg,的,水溶液，以蒸馏水为空白，在,1cm,厚的吸收池中,于,278nm,处，测得百分透光率为,24.3,。,（已知,M,323.15,）,注意：,1.,吸光系数的测定不能在高浓度的溶液中进行。,2.,必须应用物质的标准品（物质的纯品）进行测定。,3.,吸光系数是物质的特性常数，与溶液的浓度无关。,则,讨论：,1,）,K,=,f,（,组分性质，温度，溶剂，,）,当组分性质、温度和溶剂一定，,K,=,f,（,）,2,）,不同物质在同一波长下,K,可能不同（选择性,吸收）,同一物质在不同波长下,K,一定不同,3,）,K,，,物质对光吸收能力,定量测定方法,灵敏度,定性、定量依据,吸收定律与吸收光谱的关系,A,C,吸光定律,A,或,吸收光谱,A,C,max,三维谱图,吸光的加合性,多,组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即,对,吸收定律偏离,A,C,主要原因,非单色光,光学因素,吸光质点的相互作用,化学因素,三、偏离,Beer,定律的因素,(,一,),化学因素,Beer,定律适用的一个前提：稀溶液,浓度过高会使,c,与,A,关系偏离,Beer,定律,随着溶液浓度的改变，溶液中的吸光物质可因浓度的改变而发生,离解,、,缔合,、,溶剂化,以及,配合物生成,等的变化，使吸光物质的存在形式发生变化，影响物质对光的吸收能力，因而偏离,Beer,定律。,质点间相互作用,c,吸收质点间隔,变化,例,重铬酸钾的水溶液中存在下列平衡：,Cr,2,O,7,2-,H,2,O,=,CrO,4,2-,2,H,若将溶液严格地稀释,2,倍，则溶液中,Cr,2,O,7,2,离子的浓度不是恰好减少为原来的一半，而是受稀释平衡向右移动的影响，,Cr,2,O,7,2,离子浓度的减少多于原来的一半，结果导致偏离,Beer,定律而产生误差。,例：,聚合引起的对吸光定律的偏离（亚甲蓝阳离子水溶液）,2,max,=660 nm,二聚体：,max,=610 nm,A,C,max,=660 nm,单体：,A,660 nm,610 nm,（二）光学因素,1,非单色光的影响：,Beer,定律应用的重要前提,入射光为单色光,照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光,其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定,为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度,这就使分离出来的光具一定的谱带宽度,讨论：,入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状,结论：,选择较纯单色光（,，,单色性,）,选,max,作为测定波长（,，,S,且成线性）,成线性关系,A,与,c,不成线性关系，偏离,Beer,定律,A,与,c,偏离线性关系越严重,2,杂散光的影响：,杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远,杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成,杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变化。,3,反射光和散射光的影响：,反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光,直接对,T,产生影响,散射和反射使,T,，,A,，,吸收光谱变形,注：一般可用空白对比校正消除,4,非平行光的影响：,使光程,，,A,，,吸收光谱变形,三、透光率的测量误差,T,影响测定结果的相对误差两个因素：,T,和,T,透光率,标 尺,由图可见,：,1,）当,T,一定，,T,较大和较小时，,c,/,c,均较大；,2,）,T,在,65%-20%,（即,A,为,0.2-0.7,）时，由,T,引起的,E,r,较小；,3,）当,T,=e,-1,=0.368,即,A=0.434,时，,E,r,最小。,表明测量误差较小的范围,一直可延至较高吸光度区，,对测定有利,3-3,显色反应及其显色条件的选择,有机物质,官能团强吸收,直接测定,UV-VIS,官能团弱吸收,衍生化反应,UV-VIS,显色,反应,无机物质,通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度,3,3,2+,桔红色,max,邻二氮菲,显色剂的用量,M +,nR,=,MR,n,定量反应,实际工作中，作,A,c,R,曲线，寻找适宜,c,R,范围。,c,R,c,R,c,R,酸度的选择,酸度的影响,副反应,M +,nR,=,MRn,OH,-,H,+,存在型体的变化,RH,=,R,-,+H,+,1,2,生成不同配比的络合物,例，磺基水杨酸,Fe,3+,pH=2 3,FeR,紫红色,pH=4 7,FeR,2,橙色,pH=8 10,FeR,3,黄色,酸度的选择,理论计算,以,作图,可得,适宜,pH,范围,实际工作中，作,A pH,曲线，寻找适宜,pH,范围。,A,pH,M +,nR,=,MRn,OH,-,H,+,温度的选择,实际工作中，作,A,T,曲线，寻找适宜反应温度。,A,T,A,T,A,T,A,T,A,T,反应时间的选择,实际工作中，作,A,t,曲线，寻找适宜反应时间。,测量条件的选择,选择适当的测量波长,原则：吸收最大，干扰最小，准确度高,选择没有吸收干扰、吸光度较大而且峰顶比较平坦的,最大吸收波长。,选择适宜空白溶液,I,0,I,t,参比,样品,I,r,I,0,I,0,I,r,参比溶液,I,a,空白溶液的选择,原则：,扣除非待测组分的吸收,以显色,反应为例进行讨论,M +R =,M-R,max,试液 显色剂 溶剂 吸光物质 参比液组成,无,吸收,无,吸收,光学透明,溶剂,基质吸收,无,吸收,吸收,不加显色剂的试液,无,吸收,吸收,吸收,显色剂,基质吸收,吸收,吸收,吸收,显色,剂,+,试液,+,待测组分的掩蔽剂,若欲,测,M-R,的吸收,max,A,（,样）,=A,（,待测吸光物质）,+,A,（,干扰）,+A,（,池）,A,（,参比）,=,A,（,干扰）,+A,（,池）,选择适当的溶剂,紫外,-,可见光谱一般是在相当稀的溶液,(10,-2,10,-6,mol/L),中测定的。在选择溶剂时需注意：,(1),溶质易溶，两者不发生化学作用；,(2),具有适当的沸点，在测量过程中溶剂的挥发不至于明显影响样品的浓度；,(3),具有适当的透光范围，不影响样品吸收曲线的测定。,(4),价廉易得，使用后易回收。,一、工作原理及仪器结构框图,光源,碘钨灯,氘灯,单色器,测量池,参比池,样品池,光电管,数据处理和仪器控制,光源,样品池,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,3-4,紫外,-,可见分光光度计,紫外,-,可见分光光度计组件,光源,单色器,样品池,检测器,信号输出,氢,灯，氘灯，,185 350 nm,；,卤钨灯，,250 2000,nm.,基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定,作用：将复合光色散成单色光,棱镜,光栅,玻璃，,350 2500,nm,石英，,185 4500,nm,平面反射光栅,玻璃，光学玻璃，石英,作用：将光信号转换为电信号，并放大,光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）,表,头、记录仪、屏幕、数字显示,二、主要部件,1.,光源（辐射源）,（,1,）光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱,;,光辐射强度随波长的变化小,;,有足够的使用寿命,钨灯,（钨的熔点为,3680K,）；,波长范围：,3202500nm,；,工作温度：,3000K,；,I,hv,V,34,（,2,）白炽光源,常用类型：白炽光源与气体放电光源,卤钨灯：,在钨灯中加入卤化物提高白炽灯的使用寿命,（,3,）气体放电光源,氢弧灯,（氢灯）：波长范围：,165350nm,；,氢气压力：,0.25mmHg,。,氘灯：,内充气为氘辐射强度比氢灯强,35,倍。,2.,单色器,:,平面衍射光栅,4.,检测器：,光电管,光源,碘钨灯,氘灯,单色器,测量池,CCD,检测器,数据处理和仪器控制,光二极管阵列检测器（,PDA,）,3.,测量池：,液池、样品池、比色皿。,吸收池的材料,玻璃,360 nm,2.25,m,m,石英,200 nm,2.5,m,m,吸收池的形状,波长范围,3.,使用注意事项,容易破碎,可拆卸圆形测量池,两面透光,圆形测量池,两面透光,1cm,长方形测量池,两面透光,气体测量池,两面透光,微量测量池,两面透光,流动测量池,两面透光,二、分光光度计的类型,优点：,结构简单、,价格低廉,缺点：,受光源、检测器的波动影响：不能自动记录吸收光谱。,问题：,请扼要叙述在非扫描型（单光束）的紫外,-,可见分光光度计上，人工绘制吸光物质的,UV-VIS,吸收光谱过程中需要注意的事项。,波长增量的选择；改变波长都要用参比溶液调节,T=100%,；,固定光谱通带与仪器参数；选择合适的溶液浓度与参比。,1.,单光束分光光度计,比值,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,光束分裂器,2.,单波长双光束分光光度计,优点：,能自动记录吸收光谱（自动扫描）；比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响；是目前用得最多的分光光度计,优点：,可以测定较高浓度的样品溶液；,可以扣除背景吸收（样品池、浑浊等）；,比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响；,导数吸收光谱曲线,（,=12nm),。,3.,双波长分光光度计,双波长动画,光源,检测器,单色器,单色器,切光器,吸收池,双,波长分光光度计示意图,通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差,A,。,A,B1,和,A,B2,分别为在,1,和,2,处的背景吸收，当,1,和,2,相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得,这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。,三、,分光光度计的光学性能与校正,性能指标,：波长范围；波长准确度与重复性；光度,准确度与重复性；分辨率；杂散光。,验收新仪器或,当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对其进行校正。,波长标度校正,：,使用镨,-,钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。,吸光度标度校正,：,采用,K,2,CrO,4,标准液校正 在,25,o,C,时，于不同波长处测定,0.04000g/L,的,KOH,溶液（,0.05mol/L,）,的吸光度,A,，,调整光度计使其,A,达到要求。,吸收池的校正：,3-5,分析方法,一、定性分析,1,、对比吸收光谱特征数据,2,、对比吸收度（或吸收系数）的比值,假设某物质,X,有两个吸收峰,1,和,2,，配制标准溶液和样品,溶液，使浓度相同。则：,标准溶液：,A,1,/A,2,=C,，,E,1,/E,2,=D,样品溶液：,A,1,/A,2,=c,，,E,1,/E,2,=d,如果两者为同一物质，则,C,、,D,理论上应等于,c,、,d,3,对比吸收光谱的一致性,同一测定条件下，与标准对照物,谱图或标准谱图进行对照比较,二、纯度检查,1,杂质检查,1,）峰位不重叠：,找,使主成分无吸收，杂质有吸收,直接考察杂质含量,2,）峰位重叠：,主成分强吸收，杂质无吸收,/,弱吸收,与纯品比较，,E,杂质强吸收,主成分吸收,与纯品比较，,E,，,光谱变形,2,杂质限量检测：,例：肾上腺素中微量杂质,肾上腺酮含量计算,2mg/mL0.05mol/L,的,HCl,溶液，,310nm,下测定,.,规定,A,310,0.05,即符合要求的杂质限量,0.06%,三、定量分析,依据：,Lambert-Beer,定律,波长选择依据：,最大吸收峰,无其他杂质干扰的吸收峰,不选靠短波长末端的吸收峰,（一）单组分分析,1,、吸光系数法（绝对法）,例：精密称取,B,12,样品,25.0mg,，,用水溶液配成,100ml,。,精密吸取,10.00ml,，,又置,100ml,容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在,1cm,的吸收池中，于,361nm,处测定吸光度为,0.507,，求,VB,12,的百分含量？,解:,2.,标准曲线法,线性回归,(,最小二乘法,),3,、标准对照法,例：维生素,B,12,的含量测定,精密吸取,B,12,注射液,2.50mL,，,加水稀释至,10.00mL,；,另配制对照液，精密称定对照品,25.00mg,，,加水稀释至,1000mL,。在,361nm,处，用,1cm,吸收池，分别测定吸光度为,0.508,和,0.518,，求,B,12,注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该,B,12,注射液的标示量为,100g/,mL,）,解:,（二）多组分分析,由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定,多个组份。,1,、解线性方程组法,步骤：,消除,a,的影响测,b,2.,双波长法,-,等吸收点法,消去,b,的影响测,a,注：须满足两个基本条件,选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点,选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大,步骤：,b,曲线上任找一点,1,另一点,2,优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号,K,倍，,提高了待测组分测定灵敏度,a,b,1,2,4.,导数光谱法,根据,Lambert-Beer,定律,A=,bc,，因仅只有,A,和,是波长,的函数，故对波长,进行,n,阶求导后可得,随导数阶数的增加，峰形越来越尖锐，因而导数光谱法分辨率高（右图）。,吸收峰数为：导数阶数,+1,，即,n+1,10ppm,苯的乙醇液,1ppm,苯的乙醇液,纯乙醇,1ppm,苯的乙醇溶液，,一阶导数光谱,基本光谱,1ppm,苯的乙醇溶液，,四阶导数光谱,选,择,性,及,灵,敏,度,均,提,高,（苯的,导数信号）,导数光谱中定量数据的测定方法目前应用最广泛,的是几何法,基线法（切线法）：测量相邻两峰（或谷）中间极值到其公切线的距离（,t,）；,峰谷法：测量相邻峰谷间的距离,p,；,峰零法：测量极值到零线之间的垂直距离（,z,）,四,、,结构分析,（一）有机化合物的紫外吸收,1,、饱和碳氢,*,200nm400nm,无吸收,2,、含孤立助色团和生色团的饱和有机化合物,孤立助色团,n*,吸收峰比,*,长移,n,*,190 nm,孤立生色团,n,*,200 nm400 nm ,小,孤立,*,150180 nm ,大,3,、共轭烯烃,共轭双键,*,吸收峰长移，,增加,Woodward-,Fieser,规则,共轭烯烃,K,带,max,的推算,母体基本值,开链双烯,半环双烯,217,异环双烯,214,同环双烯,253,Woodward-,Fieser,规则估算最大吸收波长的几个实例：,四,*,环外双键：,1,）环外；,2,）与环相连；,3,）共轭,max,的,计算,max=253+4,5+2,5=283nm,(,实测值,=282),异环二烯,=214nm,环外双键,=5nm,烷基取代基,=35nm,计算值：,max,=234nm,测定值：,max,=234nm,注意,：,1,）只适用于共轭二、三、四烯，环烯为六元环；,2,）选择较长共轭体系作为母体；,3,）交叉共轭体系中，只取一个共轭键。分叉上的双键不算延长双键且选较长共轭体系；,4,）不适用芳香系统；,5,）所有取代基（体系中）及环外双键均应考虑在内。,若既可取同环又可取异环时，则应取能量最低（波长最长）为母体。,应用举例：,母体同环双烯,253nm,扩展双键,2 230=60nm,环外双键,3 35=15nm,烷基取代,5 55=25nm,max,=353nm,max,=114+5M+n(48.0-1.7n)-16.5Rendo-10Rexo,*,超过四个双键时，使用,Fieser,-Kuhn,规则（半经验）,取代烷基,共轭双键数,环内,环外,计算,(I),max,=214+53=229nm,(),max,=214+54+5l=239nm,因此，结构,(),是正确的,通过对,max,的计算，可以帮助确定未知物的结构：如,脱水反应可得产物,或,实测,max,=242nm,4,.,不饱和醛、酮、酸、酯,双键和羰基未共轭,*,200nm,n,280nm,*,200,左右,，,不饱和醛、酮,共轭使,*,长移至,200260 nm,约,10,4,n *,长移至,310 350 nm ,100,溶剂极性增加,*,长,移,n,*,蓝,移,不饱和酸、酯,羰基碳连有未共用电子对的助色团，,使,，,*,轨道能级提高，但,轨道提高,更大，,n,轨道能量不变。,则：,*,长移，,n,*,短移,n,165,nm,n,K,K,R,R,n,不饱和醛、酮,K,带,max,的推算,(Woodard-,Fieser,规则,),母体基本值,醛类,210,五元环烯酮,202,开链或大于五元环烯酮,215,增加值,同环共轭双烯,39,扩展共轭双烯,30,环外双键,5,取代基,及,以上,烷基,10 12 18,-OH 35 30 50,-OR 35 30 17,31,-SR 85,-,OAc,6 6 6,-,Cl,15 12,-Br 25 30,-NR,2,95,注,:,以上计算值仅适合于以,95%,乙醇为溶剂,若为其它溶剂,需校正。,、,不饱和羰基化合物的溶剂校正值,溶剂 校正值,水,+8,甲醇,0,氯仿,-1,1,4-,二氧六环,-5,乙醚,-7,正己烷或环己烷,-11,注意：,1,）环上羰基不作为环外双键看待；,2,）由两个共轭不饱和羰基时，应优先选择,较大的；,3,）碳原子编号；,(,)C=C(,)-(,)C=C(,)-(X)C=O,4,）溶剂校正。,应用举例：,母体五元环烯酮,202nm,扩展双键,1 30,环外双键,1 5,烷基取代,1 12,烷基取代,1 18,烷基取代,1 18,max,=285nm,母体六元环烯酮,215nm,扩展双键,2 60,环外双键,1 5,同环共轭双烯,1 39,烷基取代,1 12,以上烷基取代,3 54,max,=385nm,-,烯酮,=215 nm,同环二烯,=39 nm,共轭双键,=30 nm,环外双键,=5 nm,位烷基取代基,=10 nm,位烷基取代基,=18 nm,计算值：,max,=317 nm,测定值：,max,=314 nm,对于有交叉共轭体系的化合物，使用较大的波长作为计算值。,例如,计算,(1),max,=215+12=227,计算,(2),max,=215+122+5=244,观测值,ma,x,(nm)=244,答案：,5,、芳香族化合物,苯、取代苯,苯,E,1,、,E,2,、,B,带,绝大多数取代基都使,E,1,、,E,2,、,B,带长移，,增大，,B,带精细结构减少,取代基,红,移影响的顺序：,供电子基,CH,3,Cl,Br,OH,OCH,3,NH,2,O,NHCOCH,3,NCH,3,吸电子基,NH,3,+,SO,2,NH,2,COO,-,CN,-,COOH,CHO,NO,2,助色团取代,n,共轭，,E,2,、,B,明显,长,移，,增加,生色团取代,共轭，,200250 nm,处出现,K,带，可能出现,R,带,取代苯吸收波长计算,芳杂环化合物,五元杂环化合物：相当与环戊二烯的,CH,2,被杂原子取代，其,UV,谱与环戊二烯相似，在,200nm,和,238nm,有两个吸收峰。,六元杂环化合物：与苯相似,但溶剂的极性对苯影响较小，对六元杂环化合物影响较强。,（二）有机化合物结构研究,（,1,）若在,200,800nm,波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃,（,2,）若在,270,350nm,波长范围内有低强度吸收峰,(,10,100Lmol,-1,cm,-1,),（,n,跃迁），则可能有一个非共轭且含有,n,电子的生色团，如羰基。,1.,从吸收光谱中初步推断官能团,（,3,）若在,250,300nm,波长范围内有中等强度的吸收峰且含有精细结构，则可能含苯环。,（,4,）若在,210,250nm,波长范围内有强吸收峰,，,则可能含有,2,个共轭双键；若在,260,300nm,波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有,3,5,个共轭双键。,（,5,）若该有机物的吸收峰延伸至可见光区，则该有机物可能是长链共轭（至少,5,个共轭单位）或稠环化合物。,2,、异构体的推断,（,1,）顺反异构体,max,214,5,45,239nm,（,实测,238nm),max,253,55,278nm,（,实测,273nm),（,2,）互变异构体,互变异构,：,酮式：,max,=204 nm,烯醇式：,max,=243 nm,3,、化合物骨架的推断,维生素,K,2,，,3,二烷基,1,，,4,萘醌,四、结构分析（辅助解析）,（1）200-400,nm,无吸收峰。饱和化合物，单烯。,（2）,270-350,nm,有吸收峰（,=10-100,）,醛酮,n,*,跃迁产生的,R,带。,（3）250-300,nm,有中等强度的吸收峰（,=200-2000,），,芳环的特征 吸收（具有精细解构的,B,带）。,（4）200-250,nm,有强吸收峰（,10,4,），,表明含有一个共轭体系（,K,）,带。共轭二烯：,K,带（,230 nm,）；,不饱和醛酮：,K,带,230 nm,，,R,带,310-330 nm,260nm,300 nm,330 nm,有强吸收峰，,3,4,5,