3-酶联免疫分析检测人甲胎蛋白2015-hw.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2015/12/25 Friday,#,酶联免疫分析检测,人,甲胎蛋白,(AFP),酶联免疫吸附测定法,(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),ELISA,现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶,技术的,基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,。,在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。,基,本原理,它,采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原,。,在这种测定方法中有,3,种必要的试剂：,固相的抗原或抗体（,免疫吸附剂）,酶标记的抗原或抗体（,标记物）,酶作用的底物（,显色剂）,测量,时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫,活性；,然后,加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记,物），,此偶联物仍保留其原免疫活性与,酶活性；,当,偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后,，,再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色,。,其,所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。,这种,有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定,。,其,方法简单，方便讯速，特异性强。,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相,载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的,抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体,表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成,固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他,未结合的物质,加酶标抗体生成,抗体,待测抗原,酶标记抗体,的复合物,彻底洗涤,未结合的,酶标抗体,加底物进行,酶催化反应,根据颜色反应的,程度进行该抗原,的定性或定量测定,双抗体夹心法,:,适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,概述,-,甲胎蛋白,AFP,一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎,的肝细胞，,胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到,20,微克,/,升。,在成人，,AFP,可以在大约,80%,的肝癌患者,血清中升高，,在生殖细胞肿瘤出现,AFP,阳性率,为,50%,。,在,其它肠胃管肿瘤,如胰腺癌或,肺癌,及肝硬化等,患者亦可出现不同程度的升高。,目的,：,ELISA,法定量测定,人,血清、血浆、细胞培养上清或其他相关生物液体中甲胎蛋,AFP,的,含量,。,掌握,ELISA,的工作原理、适用对象和操作方法。,实验原理：,用双,抗体夹心法测定标本中人,AFP,水平,。,用,纯化,的人,AFP,抗体包被微孔板，制成,固相载体，,往包被单抗的微孔中依次加入,标本或标准品,，再与,HRP,标记的,AFP,抗体,结合，形成抗体,-,抗原,-,酶标抗体,复合物；,经过,彻底洗涤后加底物,四甲基联苯胺（,TMB,）显色；,TMB,在,HRP,酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的,黄色；,颜色,的深浅和样品中的,AFP,呈正,相关。用酶标,仪,450nm,波长下测定吸光度（,OD,值），通过标准曲线计算样品中,人甲,胎蛋白（,AFP,）浓度。,试剂,盒组成,：,1.,酶联板：一块（,96,孔）,2.,标准品,3.HRP,标记的抗,AFP,抗体,4.TMB,显色,5.,浓洗涤液,6.,终止液,1.,取出试剂盒，室温放置,30,分钟。,2.,分组：取出,96,孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（,5,个浓度）、空白孔,（,1,个）,、待测样品组,（共,12,个）,。,注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。,3.,加样：,标,准品、,待测样,品。,分别加入,40ul,。,空白,调零,孔,：不加任何试剂。,注,意不要有气,泡。,将,样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。,4.,温育：用封板膜封板后置,37,温育,35,分,钟。,5.,洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加,300ul,洗涤液，静置,1,分,钟,弃去，如此重复,5,次,，拍干。,操作步骤,6.,加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入,100ul,的,HRP,标记的抗,AFP,抗体，,空白,调零,孔除外。,37,温育,35,分,钟,。,7.,洗涤,：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加,300ul,洗涤液，静置,1,分,钟,弃去，如此重复,5,次,，拍干。,8.,显,色：各孔加入显色剂,A,液,50ul,后，再加入显色剂,B,液,50ul,。,轻轻震荡混匀，,37,避光显色,15,分钟,(,空白孔需加,).,9.,终止,：加,入,50ul,终止,液,(,空白孔需加,),。,终止反应（此时蓝色立转黄色）。,10.,读板：,以空,白孔调,零，,在,450nm,波长读取各孔的,OD,值,。测,定应在加终止液,后,15,分,钟以内进行。,操作步骤,注意事项,1.,试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡,15-30,分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。,2.,浓,缩,洗液可能会有结晶析出，在水浴中加温助溶。,3.,加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在,5,分钟内。,4.,请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本,OD,值大于标准品孔第一孔的,OD,值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（,n,倍）后再测定，计算时最后乘以总稀释倍数（,n,5,）。,计算,以标准,品,的浓度为横坐标，,OD,值为纵坐标，绘出标准曲线,。然后,根据样品的,OD,值,计算出样品,的浓度,，,再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。,5.,封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。,6.,底物请避光保存。,7.,严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准,.,