02-氨基酸.ppt

*,第,2,章,氨基酸和蛋白质的一级结构,2.1 氨基酸,2.1.1 氨基酸的种类和结构,2.1.2 非标准氨基酸,2.1.3 氨基酸的旋光性和构型,2.1.4 氨基酸的酸碱性质,2.2 氨基酸分离和分析,2.2.1 氨基酸的电泳分离,2.2.2 离子交换层析,2.3 肽,2.3.1 肽、肽键和肽链,2.3.2 肽的性质,2.3.3 生物活性肽,2.4 蛋白质的分离与鉴定,2.4.1 溶解性质和盐析分离,2.4.2 离子交换柱层析,2.4.3 凝胶过滤层析,2.5 蛋白质的一级结构测定,1,按侧链基团的性质分类：,非极性氨基酸,极性但不带电荷氨基酸,带电荷氨基酸。,氨基酸,2.1,标准氨基酸,非标准氨基酸,2,标准氨基酸的,结构通式（,除脯氨酸外）,与羧基相邻的碳都有一个氨基，氨基酸,标准氨基酸（20种）,合成蛋白质的原始单位，未经化学修饰，都有相应的遗传密码子,1,3,非极性氨基酸,4,极性但不带电荷氨基酸,5,带电荷氨基酸,赖氨酸Lys 精氨酸Arg 组氨酸His,天冬氨酸Asp 谷氨酸Glu,6,中文名称,3字母缩写 单个字母,甘氨酸 Gly G,丙氨酸 Ala A,缬氨酸 Val V,亮氨酸 Leu L,异亮氨酸 Ile I,氨基酸名称的缩写符号,每个氨基酸都有一个3英文字母缩写组成的符号,与之相对应，有时还用单个字母符号来代表氨基酸。,B:Asn/Asp,Asx,Z:Glu/Gln,Glx,无J、O、U、X,7,甘丙缬亮异脂链丝苏半蛋羟巯添天谷精赖组酸碱脯酪苯色杂芳环天门酰胺谷酰胺都有密码属常见,赖色缬，苏亮亮，苯蛋。,二十种氨基酸：,人体所必须的八种氨基酸：,8,色氨酸 和 靛蓝染料,靛蓝染料,：牛仔布染色,1.古人从崧蓝等植物中提取靛蓝染料,2.现代化学工业则利用煤或石油制取靛蓝,3.基因工程生产靛蓝：,对大肠杆菌进行基因改造，使它能够产生大量,色氨酸,，并能将色氨酸转换成靛蓝染料的前体,吲哚酚,，后者暴露在空气中就能变成,靛蓝,。,这种技术产生的有害废物比化学方法少,9,非标准氨基酸,以标准氨基酸为基础，经化学修饰后产生的。,2,10,-氨基丁酸(-aminobutyric acid,GABA),：抑制性神经递质,L-谷氨酸,-氨基丁酸,V,B6,11,牛磺酸(t,aurine),：胆汁酸的组成成分,L-半胱氨酸,磺酸丙氨酸,牛磺酸,12,组胺(,histamine),：,血管舒张剂,5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),：,脑内抑制性神经递质，外周组织收缩血管,13,氨基酸的构型与旋光性,3,Gly一种构型,无旋光性,Thr和Ile有四种光学异构体。,其余17种氨基酸有两种光学异构体：,L型、D型。,从蛋白质中分离出来的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）,14,看看有几个不对称C原子？,15,内消旋物,：分子内消旋,胱氨酸有三种立体异构体：,L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。,L-胱氨酸和D-胱氨酸是,外消旋物,16,氨基酸,酸碱性质,4,在生理pH值下，-氨基酸既可以作为一种酸释放出H,+,又可以作为一种碱接受H,+,，它是一种两性电解质。在水溶液中主要以两性离子形式存在。,氨基酸,两性电离,17,氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH,3,+,)形式存在，羧基是以离解状态(-COO,-,)存在。,在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。,PH 1 7 10,净电荷+1 0 -1,正离子 两性离子 负离子,等电点,PI,18,氨基酸,酸碱滴定曲线,氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线,HA A,-,+H,+,酸 碱 质子,pH=pK,a,/,+LogA-HA,（1）pK,a,/,就是HA50%解离（碱=酸）时溶液的pH值，,K,a,/,就是此时溶液的H,+,（2）当HA50%解离时，溶液的pH值等于pK,a,/,（3）pH =pK,a,/,时，碱 =酸（50%解离）,pH pK,a,/,时，碱 酸（50%解离）,pH 碱（50%解离）,pK：可电离基团的特征性电离常数的负对数值。,pK值可以通过氨基酸的酸碱滴定曲线来测定。,pK,a,/,19,-羧基pK,1,在2.0左右，当pH3.5，-羧基以-COO,-,形式存在。,-氨基pK,2,在9.4左右，当pH pI时，氨基酸带负电荷，COOH 解离成-COO,-,，向正极移动。,pH=pI时，氨基酸净电荷为零,pH 中性氨基酸(A,1+,)酸性氨基酸(A,0,),29,肽,2.3,肽、肽键和肽链,1,肽,一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水,缩合，通过酰胺键共价结合而成的化合物。,肽键,蛋白质分子中氨基酸残基之间的,酰胺键,肽链,氨基酸的线性聚合形成的链状分子,由二个氨基酸分子缩合而成的肽，称为二肽。,其中，包含一个肽键。,30,N,C,OH,R,H,C,1,2,3,n,4,H,O,H,N,C,R,H,C,O,H,N,C,R,H,C,O,H,N,C,R,H,C,O,H,N,C,R,H,C,O,H,多肽链的结构,肽键,AA残基,氨基酸残基,多肽链上的每个氨基酸，由于形成肽键而失,去了一分子水，成为不完整的分子形式。,肽键,氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），,蛋白质分子中AA残基连接的基本方式。,31,寡肽,含有三个、四个、五个氨基酸残基的肽，分别称为三肽、四肽、五肽等(十个以内)。,多肽,含有40个以上氨基酸残基的肽。,每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，称为羧基端或C-末端,32,肽的性质,2,含有游离N-末端和C-末端,通常侧链含有可解离基团,肽是一种两性电解质,33,生物活性肽,3,谷胱甘肽,GluCysGly,参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，,维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。,还原型谷胱甘肽，含有游离SH基，用GSH表示,氧化型谷胱甘肽，含二硫键，用GSSG表示,H,2,O,2,+2GSH 2H,2,O+GSSG,34,GSH,过氧化物酶,H,2,O,2,2GSH,2H,2,O,GSSG,GSH,还原酶,NADPH,+,H,+,NADP,+,35,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽,(,neuropeptide,),多肽类激素及神经肽,36,L-Leu-,D-Phe,-L-Pro-L-Val,L-Orn,L-Orn,L-Val-L-Pro-,D-Phe,-L-Leu,短杆菌肽S（抗生素）,37,蛋白质的分离与鉴定,2.4,蛋白质的溶解性质与盐析分离,1,盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度，称盐溶。,盐析：高盐浓度时，使pr溶解度析出，称盐析。,盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH,4,),2,SO,4,、,NaCl、MgCl,2,、NH4Cl、KCl等的饱和溶液,32,透析：除去盐析所得的pr中的盐类和其它小分子。,38,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,39,离子交换柱层析,2,34,依据：利用蛋白质带电性质的差别,离子交换剂：纤维素离子交换剂、琼脂糖离子交换剂,阳离子交换剂：,羧甲基（CM）适合分离pI7,阴离子交换剂：,二乙基氨基乙基（DEAE）,适合分离pI7的蛋白质,蛋白质和离子交换剂的静电吸引力，与溶液pH值有关。,改变洗脱液的盐类离子强度和pH，可对蛋白质混合物,进行分级洗脱分离。,40,41,蛋白质表面有许多极性基团，同时也存在少量疏水基团。根据蛋白质表面疏水侧链的多少和疏水性的差异，可以分离纯化蛋白质。,在柱层析的填料基质上连接一些疏水基团，可以利用蛋白质疏水侧链与层析基质上的疏水基团的相互作用，进行蛋白质的分离纯化。,疏水层析,3,35,42,又称分子排阻、分子筛层析,凝胶过滤层析,4,35,葡聚糖凝胶（Sephadex）;,琼脂糖凝胶（Sepharose）,43,根据蛋白质分子的大小和形状差异,混合的蛋白质样品按其分子大小依次洗脱、彼此分离,大的先洗脱、小的后洗脱,44,配体：,能与某种蛋白质专一结合的分子,亲和层析：,根据蛋白质的配体专一性分离目标蛋白,激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素，酶与酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物。,免疫亲和层析,亲和层析柱抗体,：,分离蛋白质混合液中的抗原,亲和层析,5,36,45,电泳：带电质点在电场中的移动速度和方向主要取决于它们的电荷性质、电荷数目、颗粒大小及形状。,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),非变性.(Native-PAGE),SDS-.(SDS-PAGE),双向电泳,毛细管电泳,蛋白质电泳,6,37,46,SDS：十二烷基硫酸钠，带负电荷的阴离子去垢剂。,蛋白质用SDS处理后，高级结构解体，带净负电荷，凝胶电泳时的迁移率和它们的相对分子量成正比。,可用于测目标蛋白的相对分子量。,SDS-PAGE,39,47,蛋白质一级结构的测定,2.5,2.5.1 蛋白质结构概述,2.5.2 蛋白质一级结构测定,2.5.3蛋白质与生物进化,2.5.4完全不同的蛋白质可能来自同一个祖先,2.5.5蛋白质一级结构的个体差异,48,蛋白质一级结构概述,它是指蛋白质多肽链的氨基酸顺序。,1,多肽/蛋白质：氨基酸残基数超过40的多肽,蛋白质的四级结构,多体蛋白/寡聚体蛋白：由一条以上多肽链构成的蛋白质,单体蛋白：由一条多肽链构成的蛋白质,41,49,蛋白质一级结构测定,它是指蛋白质多肽链的氨基酸顺序的测定。,2,42,自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，,现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,50,蛋白质测序的一般步骤：,（1）,测定蛋白质分子中多肽链的数目,（2）,拆分蛋白质分子中的多肽链。,（3）,断裂链内二硫键。,（4）分析多肽链的N末端和C末端。,（5）,测定多肽链的氨基酸组成。,（6）,多肽链部分裂解成肽段。,（7）,测定各个肽段的氨基酸顺序,（8）,确定肽段在多肽链中的顺序。,（9）,确定多肽链中二硫键的位置。,51,每条多肽链都有一个N-末端残基和一个C-末端残基。,对末端残基进行分析能够确定多肽链的数量。,末端分析,N端分析 DNS-cl（,丹磺酰氯,）法：DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸，在紫外光激发下产生黄色荧光，灵敏度极高。,52,还原法：先用2巯基乙醇处理使二硫键还原成巯基，再用烷化剂修饰巯基，阻止二硫键再度形成。,氧化法：先用过甲酸使二硫键断裂，生成半胱氨磺酸。再用烷化剂修饰巯基,拆开多肽链之间或链内的二硫键。,获得伸展的肽链以利于后续的反应。,二硫键拆开,44,53,酸水解的同时辅以碱水解。确定肽链中各种,氨基,酸,出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。,氨基酸组成分析,酸水解：,HCl（6mol/L），回流煮沸20h，完全水解。不引起消旋作用，得到L-AA，但是，色AA完全被沸酸所破坏，羟基AA（丝氨酸及苏氨酸）有一小部分被分解，天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基被水解下来,碱水解：,与NaOH(5mol/L)共煮10-20h,完全水解。色氨酸是稳定的，但是，产生消旋现象，所得产物是D型和L型氨基酸的混合物（称消旋物），丝氨酸及苏氨酸Arg，Cys会受到破坏。,54,胰蛋白酶：,-,Lys X-、-Arg X-(X Pro),胰凝乳蛋白酶：,-TyrX-、-TrpX-、-PheX-(X Pro),溴化氰：,-,MetX,-,产率85%,每一种方法产生的碎片都是不同的，但是一定有部分的重叠序列。每个碎片分别测序，然后利用重叠重构完整的肽链氨基酸顺序。,其它的酶也可以部分水解蛋白质多肽链,肽链的部分水解,将蛋白质多肽链进行部分水解，产生大小不同的肽碎片，便于进一步的顺序分析。,47,55,1,Edman,法,（1）耦联 PITC H,NA-B-C-D,pH89，40,PTCA-B-C-D,（2）裂解 无水三氟乙酸（TFA）,ATZA +H,2,NB-C-D,（3）转化 PTHA,PITC：苯异硫氰酸酯,PTC肽：苯氨基硫甲酰肽,ATZ：噻唑啉酮苯胺；ATZ氨基酸,PTH：苯乙内酰硫脲；PTH氨基酸,肽碎片的氨基酸顺序测定,56,2,羧肽酶法,羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a,羧肽酶B：只水解Arg、Lys,如果C端第二个残基是Pro，则羧肽酶A、B不起作用。,羧肽酶C：能水解包括Pro、Arg、Lys在内的所有C端a.a,N端 H,2,N ValSerGly C端,57,肽段拼接成肽链,16肽，端H 端,法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT,法裂解：SEO WTON VERL APS HO,重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS,二硫键的确定,用酶水解，分离出二硫键交联的肽碎片，拆开二硫键,，测定每个含Cys的肽碎片的氨基酸顺序；再把肽碎片顺序与整个肽链顺序比较，即可确定二硫键的位置。,对角线电泳法,49,58,二硫键的确定（对角线电泳法）,第一向电泳,胃蛋白酶酶解,没有断开二硫键,的多肽链蛋白质(二硫键完好),过甲酸氧化SS生成-SO,3,H,(二硫键断裂),第二向电泳,分离出含二硫键的两条短肽，,测序，并与拼接出的肽链比较，,定出二硫键的位置。,59,1.测定蛋白质基因的顺序可以推测蛋白质的一级结构,DNA,mRNA 蛋白质,2.数据库可提供不同蛋白质顺序的信息,蛋白质一级结构的其它来源,密码子,60,1.,自学解题指导,2、7、8、10、18、19、22、42、47,2.,作业本上的作业,要写明理由，以及注明改知识点在书上的页码,试卷1:二.2;,试卷2:二.9;,试卷4:一.1、2；四.1;,试卷5:一.2；四.1;,复习/自学/作业,61,8种人体必需的氨基酸的作用,已知基本氨基酸有二十种，其中赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸8种氨基酸，人体不能自己制造，我们称之为必须氨基酸，需要由食物提供。此外，人体合成精氨酸、组氨酸的力不足于满足自身的需要，需要从食物中摄取一部分，我们称之为半必须氨基酸。其余的十种氨基酸人体能够自己制造，我们称之为非必须氨基酸。,62,亮氨酸,功能：,促进睡眠 减低对疼痛的敏感 缓解偏头痛缓和焦躁及紧张情绪 减轻因酒精而引起人体中化学反应失调的症状，并 有助于控制酒精中毒,参考食物：,牛奶、鱼类、香蕉、花生及所有含丰富蛋白质的食物,63,赖氨酸,功能：,可减低或防止单纯性疱疹感染（热病疱疹和口 唇疱疹）的发生 能使注意力高度集中 使制造能量的脂肪酸可被正常利用 有助于消除某些不孕症,参考食物：,鱼肉、豆类制品、脱脂牛奶、杏仁、花生、南瓜子和芝麻,64,苯丙氨酸,功能：,降低饥饿感 提高性欲 改善记忆力及提高思维的敏捷度 消除抑郁情绪,参考食物：,面包、豆类制品、脱脂牛奶、杏仁、花生、南瓜子和芝麻,65,异亮氨酸、缬氨酸,功能：,血红蛋白形成必需 调节糖和能量的水平，帮助提高体能 帮助修复肌肉组织 加快创伤愈合 治疗肝功能衰竭 提高血糖水平，增加生长激素的产生,参考食物：,鸡蛋、大豆、黑麦、全麦、糙米、鱼类与奶制品,66,苏氨酸,功能：,是协助蛋白质被人体吸收、利用所不可缺少的氨基酸 防止肝脏中脂肪的累积 促进抗体的产生，增强免疫系统,参考食物：,肉类等,67,蛋氨酸,功能：,帮助分解脂肪，能预防脂肪肝、心血管疾病和肾脏疾病的发生 将有害物质如铅等重金属除去 防止肌肉软弱无力 治疗风湿热和怀孕时的毒血症 一种有利的抗氧化剂,参考食物：,大豆、其它豆类、鱼类、大蒜、肉类、洋葱和酸奶,68,色氨酸,功能：,有助于减轻焦躁不安感 促进睡眠 可控制酒精中毒,参考食物：,糙米、肉类、花生米、大豆蛋白,69,氨基酸是酱油中最重要的营养成分，其含量的高低反映了酱油质量的优劣。氨基酸是蛋白质分解的产物，酱油中的氨基酸有,18,种，它包括了人体,8,种必需氨基酸。,70,