基因工程操作课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,在这三种方法中，哪些方法是要求知道基因的核苷酸序列的？,要求知道基因的核苷酸序列,1、从基因文库中获取目的基因,（1）.基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有RNA聚合酶结合位点:,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,与RNA聚合酶结合位点,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是_,的，边_边_,编码区是间隔的、,_的，先_后_,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,1下列关于基因结构的认识中，正确的是 （）,A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列,B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子,C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游,D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列,2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（）,A编码区都有能编码蛋白质的序列,B编码区都是连续的,C非编码区都能调控遗传信息的表达,D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,提取某种生物的,全部,DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,（2）.基因文库的构建方法,基因组文库的构建,提取某种生物的,某器官,或,特定发育时期,的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-,逆转录法：,mRNA,RNADNA杂合双链,单链DNA,双链DNA,逆转录,（cDNA）,DNA聚合酶,真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码系列,。即不含,非编码区,和,内含子,某生物体内全部,DNA,许多,DNA,片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接导入,部分基因文库,（,cDNA,文库）,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物某个时期的,mRNA,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在,不知道目的基因核苷酸序列,的情况下，获得所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的,A、染色体DNA B、线粒体DNA,C、总mRNA D、tRNA,目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A、某生物的全套基因就是一个基因文库,B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,2、利用PCR技术扩增目的基因,(1)概念：,PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,PCR技术,(2)原理：,(3)前提：,(4)原料：,(5)优点,(6),过程：,PCR扩增仪,DNA复制,已知目的基因的一段核苷酸序列,：以_方式扩增，,在短时间内大量扩增目的基因,指数,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）,变性,复性,延伸,过程：,a、DNA变性,（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火,（,复性,55-65）：系统温度降低，,引物,与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在,Taq酶,的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.,重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在,基因较小，核苷酸序列已知的情况下，,可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,这是,在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法,一、目的基因的获取,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：cDNA文库,课堂小结：,1、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,二、基因表达载体的构建（核心）,为什么要构建基因表达的载体？,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。,（2）用_切断目,的基因，使其产生_,_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,2.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,Hin d,限制酶,Hin dIII,Hin dIII,目的,DNA,质粒,构建表达载体,四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因,DNA,连接酶,人类胰岛素的基因,选择带两个标记基因的质粒有什么目的？,思考：作为基因工程表达载体，,只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,2.基因表达载体的组成：,它们所处的位置和有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,载体,与,表达载体,的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,启动子、终止子：,对于目的基因表达必不可少。,目的基因不能单独进入受体细胞，,必需以表达载体的方式携带进去。,基因表达载体的构建不可能是千篇一律的,注意,常用的受体细胞：,原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌,真核生物：酵母菌和动植物细胞,三、将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、,将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可,转移至受体细胞,并,整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,整合,植物细胞染色体DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的,表达载体,DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,常用于单子叶植物的转化方法,（2）,基因枪法微弹轰击法,特点：成本高,常用于,单子叶植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,（3）花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、,将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,早期胚胎,新性状动物,3、,将目的基因导入微生物细胞,常用法,：Ca,2+,处理,常用菌,：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：,繁殖快,、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,小结：,将目的基因导入受体细胞,1.,将目的基因导入植物细胞,转化,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.,将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.,将目的基因导入微生物细胞,Ca,2+,处理,植物基因工程,动物基因工程,微生物基因工程,常用方法,受体细胞,比较目的基因导入不同细胞的方法,农杆菌转化法,显微注射法,Ca,2+,处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,想一想：用各种方法进行导入时，导入的是目的基因还是表达载体？,（一）、检测（分子水平）,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA,.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）,方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,四、目的基因的检测与鉴定,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,（1）,方法:,分子杂交,方法,:,抗原抗体杂交,（2）,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,小结：目的基因的检测与鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定,活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子水平,方法,检测对象,2、下列属于获取目的基因的方法的是(),利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用PCR技术,利用DNA转录 人工合成,A.B.C.D.,1,在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540,B.8100 C.17280 D.7560,加热至,95,摄氏度的目的是使,DNA,中的,断裂，这一过程在细胞内是通过,解旋酶,的作用来完成的。,当温度降低时，引物与模板末端结合，在,DNA,聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成,2,个,DNA,分子，此过程中的原料,，遵循的原则是,。,Taq,酶的特点是（）,A.,耐强酸,B.,耐强碱,C.,耐高温,D.,最适温度,37,摄氏度,4.,请指出,PCR,技术与,DNA,复制过程的区别,在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是,双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温,A B,C D,D,在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是,A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,A B C D,A,D,目的基因与运载体结合所需的条件有,同一种限制酶 具有抗性基因的质粒,RNA聚合酶 目的基因,DNA连接酶 四种脱氧核苷酸,ATP,A B,C D,（多选）一个基因表达载体的构建应包括,A目的基因 B启动子,C终止子 D标记基因,ABCD,D,下列关于基因表达载体的叙述不正确的是,A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用,C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选,D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是,A结构简单、操作方便 B繁殖速度快,C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少,2、基因工程常用的受体细胞有,大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞,A B,C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A.人工合成基因,B.目的基因与运载体结合,C.将目的基因导入受体细胞,D.目的基因的检测和表达,C,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是,检测受体细胞中是否有目的基因 检测受体细胞中是否有致病基因 检测目的基因是否转录出mRNA 检测目的基因是否翻译出蛋白质,A B,C D,C,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是,将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养,A B C D,C,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的,处，DNA连接酶作用于,处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。,（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和,法。,（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用,技术，该技术的核心是,和,。,（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的,作探针进行分子杂交检测，又要用,方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,有关基因工程的叙述正确的是 （）,A、限制酶只在获得目的基因时才用,B、重组质粒的形成在细胞内完成,C、质粒都可作为运载体,D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,C,基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A、人工合成目的基因,B、目的基因的检测和表达,C、将目的基因导入受体细胞,D、目的基因与运载体结合,（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到,A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接,B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增,C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状,D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,