实验6-血清甘油三酯与胆固醇的测定20151109-(1)(医学PPT课件).pptx

,标题文本,正文级别 1,正文级别 2,正文级别 3,正文级别 4,正文级别 5,实验,六 血清,甘油三酯与胆固醇的测定,酶法测定血清中的甘油三酯,一.,目的要求,了解血清甘油三酯酶法测定的原理,了解血清甘油三酯测定的临床意义,掌握酶,标仪测定法的原理和,操作,二实验原理,血清甘油三酯的测定是血脂分析的重要内容之一。目前，国内多数医院采用酶法测定。酶法又分为：一步终点比色法和两步终点比色法。两步法的主要优点是消除了游离甘油的干扰。,脂蛋白脂肪酶（,LPL,）可将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油在甘油激酶催化下，生成磷酸甘油，后者在磷酸甘油氧化酶（,GPO,）催化下，生成磷酸二羟丙酮和,H,2,O,2,。,H,2,O,2,在过氧化物酶（,POD,）催化下与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）及,ESPAS,（,3-,乙基,-N-(3-,磺丙基,)-3-,甲基苯胺）反应生成,紫色,醌亚胺染料。形成的醌亚胺染料色泽强度与样品中甘油三酯的含量成正比。测定标准样品溶液和待测血清样品反应生成的醌亚胺染料吸光度（,A,）值，即可求出待测血清样品中甘油三酯的浓量,。,二实验原理,反应如下：,甘油三酯（,TG,）,3H,2,O,甘油,ATP,甘油,-1-,磷酸,O,2,H,2,O,2,4-AAP,ESPAS,目前,，,TG,测定试剂盒多根据以上原理配制，用一步终点法测定。,甘油,3RCOOH,（脂肪酸）,甘油,-1-,磷酸,ADP,磷酸二羟丙酮,H,2,O,2,醌亚胺 染料,4H,2,O,LPL,三器材及试剂,1,器材：,酶标仪，酶标板，,37,度恒温箱，移液枪。,2.,试剂：,一,步法,：,Tris-HCl,缓冲液（,pH7.6,，浓度为,150mmlo/L,），,LPL,或脂肪酶（,3000u/L,），甘油激酶（,GK,）（,250u/L,），,ATP,（,0.5mmol/L,），磷酸甘油氧化酶（,GPO,）（,3000u/L,），过氧化物酶（,POD,；辣根）（,1000u/L,），胆酸钠（,3.5mmol/L,），硫酸镁（,17.5mmol/L,），,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）（,1mmol/L,），,4-,氯酚（,3.5mmol/L,），,Triton X-100,（,0.1g/L,）,。,四,操作步骤,取酶标条,1,个（每个样品,2,个重复），按下表操作：,试剂（,ul,）,空白管,标准管,测定管,蒸馏水,3,2.26mmol/L,标准品,(TG),3,样本,3,酶试剂（工作液）,300,300,300,37,保温,5min,，空白调零，,550nm,处测定各孔,A,值。,五,计算,（标准液浓度,=,2.26,mmol/L,）,（,mmol/L,）,正常参考值：,0.561.7mmol/L,，老年约为：,2.26mmol/L,。,美国国家胆固醇教育计划对空腹,TG,水平分解线的修订意见为（,1993,年）：,TG,正常：,4.5mmol/L,胰腺炎高危：,11.3mmol/L,六,注意事项,试剂,出现红色不能再用，试剂空白吸光度,A,550nm,0.05,；,两步法,37,4,分钟能完全排除游离,甘油；,GPO,纯度不高时，因其它氧化酶的存在而产生额外的,H,2,O,2,，使得结果偏,高；,温度控制、吸量的准确度对结果影响,较大；,甘油三酯增高常见于肥胖、糖尿病、肾病综合症、糖原沉积症、高血压、冠心病等，也随年龄而上升。降低多见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能低下、肝功能严重低下。,七,临床意义,血脂,是血浆所含脂类的统称,血浆所含脂类统称,血脂,，包括：甘油三酯、磷脂、胆固醇及其酯以及游离脂酸。,外源性,从食物中摄取,内源性,肝、脂肪细胞及其他组织合成后释放入血,定义：,来源：,血脂含量受,膳食、年龄、性别、职业及代谢,等的影响，波动范围很大。,七,临床意义,十二指肠下段及空肠上段。,中链及短链脂酸构成的,TG,乳化,吸收,脂肪酶,甘油,+FFA,门静脉,血循环,肠粘膜,细胞,饮食,脂肪在小肠被吸收,吸收,部位：,吸收,方式：,七,临床意义,消化吸收和内源性合成的脂酸，以游离的形式存在较少，大多数以酯化的形式存在于甘油三酯之中而存在于体内。,（二）甘油三酯的主要作用是为机体提供能量,（一）甘油三酯是脂酸的主要储存形式,1.,甘油三酯是机体重要的能量来源,2.,甘油三酯是机体的主要能量储存形式,男性：,21%,，女性：,26,1g TG=38kJ,七,临床意义,（三）甘油三酯是,3,分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量。甘油三酯大部分是从饮食中获得的，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存。,（四）,甘油三酯增高,常见于肥胖、糖尿病、肾病综合症、糖原沉积症、高血压、冠心病等，也随年龄而上升。降低多见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能低下、肝功能严重低下。,八,思考题,简述,酶法测定甘油三酯的原理。,正常人,空腹血清,TG,浓度是多少？说明,TG,的测定的临床意义。,酶法测定血清中的胆固醇,一.,目的要求,了解,血清胆固醇氧化酶法测定的,原理,了解,血清胆固醇测定的临床,意义,巩固酶标仪测定法的原理和,操作,二实验原理,胆固醇脂酶可将胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸。胆固醇在胆固醇氧化酶催化下，生成胆甾烯酮和,H,2,O,2,。,H,2,O,2,在过氧化物酶（,POD,）催化下与,4-,氨基安替比林（,4-AAP,）及,ESPAS,（,3-,乙基,-N-(3-,磺丙基,)-3-,甲基苯胺）反应生成紫色,醌亚胺染料。,形成的,醌亚胺染料色泽强度,与样品中胆固醇的含量成正比。测定标准样品溶液和待测血清样品反应生成的,醌亚胺染料,吸光度（,A,）值，即可求出待测血清样品中总胆固醇的浓量,。反应如下：,胆固醇酯（,TC,）,H,2,O,H,2,O,2,4-AAP,ESPAS,醌亚胺 染料,H,2,O,胆固醇,+RCOOH,胆固醇,+O,2,4,-,胆甾烯酮,+H,2,O,2,胆固醇脂酶,胆固醇氧化酶,过氧化物酶,三器材及试剂,1,器材：,（,1,）,酶标仪,（,2,）恒温,水浴,箱,三器材及试剂,2,试剂,：,四,操作步骤,取酶标条,1,个（每个样品,2,个重复），按下表操作：,37,保温,5min,，空白调零，,550,nm,处测定各孔,A,值。,试剂（,ul,）,空白孔,标准孔,测定孔,蒸馏水,3,5.17mmol/L,标准品,3,样本,3,酶试剂（工作液）,300,300,300,五,计算,标准液浓度,=5.17mmol/L,（,mmol/L,）,六,相关知识与,临床,意义,胆固醇为固醇类中的重要物质，是环戊烷多氢菲的衍生物。,胆固醇酯化的位点,六,相关知识与,临床意义,1,胆固醇的生理功能,是,生物膜的重要成分，对控制生物膜的流动性有重要作用；,是合成胆汁酸、类固醇激素及维生素,D,等生理活性物质的前体,。,六,相关知识与,临床意义,2,胆固醇在体内含量及分布,含量,：约,140,克,分布,：,广泛,分布于全身各组织中,大约,1/4,分布在脑、神经组织,肝、肾、肠等内脏、皮肤、脂肪组织中也较多,肌肉组织含量较低,肾上腺、卵巢等合成类固醇激素的腺体含量,较高,存在,形式：,游离,胆固醇,30%,胆固醇,酯,70%,六,相关知识与,临床意义,3,胆固醇的合成部位,组织定位：,除成年动物脑组织及成熟红细胞外，,几乎全身各组织均可合成，,（肝最旺盛，其次为小肠）,细胞定位：,胞液、内质网,六,相关知识与,临床意义,4,胆固醇的合成步骤,一般认为乙酸等物质在动物体内是合成胆固醇的原料。,限速酶：,HMGCoA,还原酶,合成前体,乙酸,需要,NADPH,和,ATP,高度调控,发生在细胞质,内质网,细胞液,六,相关知识与,临床意义,5,胆固醇合成的调节,限速酶,HMG-CoA,还原酶,酶的活性具有昼夜节律性,(,午夜最高，中午最低）,可被磷酸化而失活，脱磷酸可恢复活性,受胆固醇的反馈抑制作用,胰岛素,甲状腺素能诱导肝,HMG-CoA,还原酶的,合成，,又促进胆固醇转变为胆汁酸可使血中胆固醇下降,六,相关知识与,临床意义,6,胆固醇,的降解,目前一般认为胆固醇主要经由胆汁排出体外。,由于,环结构不能代谢，体内胆固醇的清除是将其转变成胆汁酸，在分泌到小肠以后，部分随粪便排出。,六,相关知识与,临床意义,7,胆固醇,的转变,类固醇激素,（肾上腺皮质激素、孕激素、,雄激素、雌激素等）,胆固醇,胆汁酸,脱氢胆固醇,维生素,D,六,相关知识与,临床意义,8,血清胆固醇测定的临床意义,(1,),血清,胆固醇浓度,可,作,为酯类代谢的标志，对糖,尿病患者的预后有重要意义。糖尿病昏迷患者几乎都伴有血清胆固醇浓度的增加。胆固醇增加还见于动脉粥样硬化、肾病综合征、总胆管阻塞及粘液性水肿。其他如肥大性骨关节炎、老年性白内障、牛皮癣等，血清胆固醇浓度间或也有增加。,（,2,）在恶性贫血、溶血性贫血以及甲状腺功能亢进时，血清胆固醇含量降低，其他如感染、营养不良等情况下，胆固醇总量常见减低。,（,3,）胆固醇酯系由胆固醇与脂肪酸结合而成，此反应主要在肝脏内进行。肝脏有实质性病变时，胆固醇的含量可显著地减少，同时在胆固醇总量内所占的比例亦明显减低，故其测定有助于肝脏疾病诊断。胆固醇酯的含量与,比例日渐减低,是,预后不良,的,征,兆。,六,相关知识与,临床意义,9,参考值,血清,胆固醇水平与性别、年龄、饮食、生活习惯、精神因素、工作性质、运动及吸烟等有关。,成人,参考值为：,2.8,6.0mmol/L,（,100,230mg/dl,）,血清,正常上限值：,5.20mmol/L,危险,阈值：,5.20-6.20mmol/L,高,胆固醇血症：,6.20mmol/L,六,相关知识与,临床意义,胆固醇,增高、降低的常见疾病,胆固醇增高 胆固醇降低,家族性高胆固醇血症 无,脂蛋白血症,LDL-R,缺陷 低,脂蛋白血症,混合性高脂蛋白血症,脂蛋白缺乏症,家族性高,HDL,血症 家族性,LCAT,缺乏症,家族性型高脂蛋白血症,内分泌疾病 严重肝脏疾病,甲状腺功能减低 急性肝坏死,糖尿病（昏迷）肝硬化,肝脏疾病 甲状腺功能亢进,阻塞性黄疸 艾迪生病,肝癌 严重营养不良,肾脏疾病 吸收不良症候群,肾病综合征 严重贫血,慢性肾炎肾病期 白血病,应用类固醇类制剂,七,思考题,1,简述酶法测定胆固醇的原理,。,2.,正常人,空腹血清胆固醇浓度是多少？说明胆固醇的测定的临床意义。,