蛋白质化学医学知识讲座优质PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质化学医学知识讲座,第一节,蛋白质概论,一、,蛋白质的化学组成与分类,1、,元素组成,碳 50%氢7%氧23%氮16%硫 0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼。氮平均含16。,凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮6.25,2、,氨基酸组成,蛋白质是由20种L-型氨基酸组成的长链分子,3、,分类,（1）,按组成：,简单蛋白：,结合蛋白：核蛋白，糖蛋白，脂蛋白，色蛋白，磷蛋白，黄素蛋白，金属蛋白,详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。,（2）、按分子外形的对称程度：,球状蛋白质 纤维状蛋白质、膜蛋白质,（3）、按功能分：,酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。,二、,蛋白质的大小与形状,少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。,多于50个aa的称为蛋白质。,蛋白质分子量=aa数目*110,三、,蛋白质分子的构象与结构层次,蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。,一级结构：氨基酸顺序,二级结构：螺旋、折叠、转角，无规卷曲,三级结构：螺旋、折叠、转角、松散肽段,四级结构：多亚基聚集,四、,蛋白质功能的多样性,1,酶,2结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）,3贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）,4物质运输（血红蛋白、Na,+,-K,+,-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、,电子传递体）,5细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）,6激素功能（胰岛素）,7具免疫防御机能（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白）,8接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）,9调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）,第二节,氨基酸,一、,蛋白质的水解,酸水解（6NHCL,在100120，1024h)：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基；不消旋。,碱水解（5MNaOH煮1020h)：消旋，色氨酸稳定；Cys,Ser,Thr,胱氨酸遭破坏。,酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱,二、,氨基酸的功能：,（1）、组成蛋白质,（2）、一些,aa,及其衍生物充当化学信号分子,-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羟色胺、褪黑激素，都是神经递质，,甲状腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素,（3）、氨基酸是许多含,N,分子的前体物,核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa,（4）、一些基本氨基酸和非基本,aa,是代谢中间物,（精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)尿素循环的中间物，,三、,氨基酸的结构与分类,基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种,稀有氨基酸：是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。,非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质(约150种)。,（一）,编码的蛋白质氨基酸（20种）,结构通式：,1、,按照,R,基的化学结构分类,（,1）、,R,为脂肪烃基的氨基酸（,5,种）,R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.00.03）,Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性,从Gly至Ile，R基团疏水性增加,（2）、,R,中含有羟基和硫的氨基酸（共,4,种）,Ser的-CH,2,OH基（pK,a,=15）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。,Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。,Cys的R中含巯基（-SH），具有两个重要性质：,（1）在较高pH值条件，巯基离解。,（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。,u,Cys与结石,Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。,（3）、,R,中含有酰胺基团（,2,种）,酰胺基中氨基易发生氨基转移反应,（4）、,R,中含有酸性基团（,2,种）,Asp、Glu,Asp侧链羧基pKa为3.86，,Glu侧链羧基pKa为4.25,它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个氨基酸,（5）、,R,中含碱性基团（,3,种）,Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（NH,3,+,），侧链的氨基反应活性增大。,Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。,His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35），是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸，PH=6.0时50质子化，PH=710质子化。,His在酶的酸碱催化机制中起重要作用,在280nm处，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱。,（6）、,芳香族氨基酸,（7）、,杂环族氨基酸,（,1,种）,Pro的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。,一般出现在两段-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，,u,必需氨基酸,：,成年人：,Thr,、Val、,Leu,、,Ile,、,Phe,、Trp、Lys、Met,婴儿期：,Arg,和,His,供给不足，属半必须氨基酸,2、,按照,R,基的极性性质可以分为,4,类：,侧链极性(疏水性程度),Gly,0,Ser,-0.3,Glu,-2.5,Lys,-3.0,Ala,0.5,Asn,-0.2,Asp,-2.5,Arg,-3.0,Met,1.3,Gln,-0.2,His,0.5,Pro,1.4,Thr,0.4,Val,1.5,Cys,1.0,Leu,1.8,Tyr,2.3,Ile,1.8,Phe,2.5,Trp,3.4,（1）、,非极性氨基酸,9种,在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心）。,（2）、,不带电何的极性氨基酸,6种,这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水,（3）、带负电荷的,aa(,酸性,aa),（4）、带正电何的,aa(,碱性,aa),胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。,Arg的胍基碱性很强，与NaOH相当。,His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。,非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。,酶的活性中心：His、Ser、Cys,（二）,非编码的蛋白质氨基酸,也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来；氨基酸代谢产物；代谢途径的中间物。,（1）4-羟脯氨酸,（2）5-羟赖氨酸,这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。,（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中）,(4)-羧基谷氨酸,存在于凝血酶原及某些具有结合Ca,2+,离子功能的蛋白质中。,（5）Tyr的衍生物：3.5-二碘酪氨酸、甲状腺素（甲状腺蛋白中）,（6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。,（三）,非蛋白质氨基酸,不组成蛋白质，但有生理功能,（1）L-型 氨基酸的衍生物,L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物,（2）D-型氨基酸,D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）,（3）-、-、-氨基酸,-Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。,三、,氨基酸的构型、旋光性和光吸收,1、,氨基酸的构型与旋光性,Gly一种构型,无旋光性,Thr和Ile有四种光学异构体。另Hyp，羟赖氨酸。,其余17种氨基酸有两种光学异构体：L型、D型。,构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸）。,氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。,表3-6 蛋白质中L型氨基酸的比旋光度,外消旋物：,D-型和L-型的等摩尔混合物。,L-苏氨酸和D-苏氨酸组成消旋物。,L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸组成消旋物,内消旋物：,分子内消旋,胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。,L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物,2、,氨基酸的光吸收性,Tyr、Phe、Trp的R基含有共轭双键，在220-300nm近紫外区有吸收。,（nm）,Tyr 275 1.410,3,Phe 257 2.010,2,Trp 280 5.610,3,Lambert-Beer：,在280nm有最大光吸收,四、,氨基酸的酸碱性质（重点）,1、,氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在,晶体溶点高 离子晶格，不是分子晶格。,不溶于非极性溶剂 极性分子,介电常数高 水溶液中的氨基酸是极性分子。,-羧基pK,1,在2.0左右，当pH3.5，-羧基以-COO,-,形式存在。,-氨基pK,2,在9.4左右，当pH pK,a,/,时，碱 酸（50%解离）,pH 碱（50%解离）,K,a,/,K,a,/,=H+A-/HA,在pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。,起点：100%Gly,+,净电荷：+1,第一拐点：50%Gly,+,，50%Gly,平均净电荷：+0.5,pH=pK+lgGly,/Gly,+,=pK,1,=2.34,第二拐点：100%Gly,净电荷：0 等电点pI,第三拐点：50%Gly,，50%Gly,-,平均净电荷：-0.5,pH=pK,2,+lgGly,-,/Gly,=pK,2,=9.6,终点：100%Gly,-,净电荷：-1,Gly的等电点：,中性氨基酸PI=12(pK1+Pk2),酸性氨基酸PI=12(pK1+Pk2),碱性氨基酸PI=12(pK2+Pk3),pH pI时，氨基酸带负电荷，-COOH解离成-COO,-,，向正极移动。,pH=pI时，氨基酸净电荷为零,pH pI时，氨基酸带正电荷，-NH,2,解离成-NH,3,+,，向负极移动。,pH离PI越远带电量越多。,问题：,（1）pH=pK,a,/,时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？,（2）pI的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例,（3）不同pH下的电泳行为和各组分比例,（4）利用pI和pK,a,/,确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围,（5）绘制滴定曲线（Glu）,根据P92页表3-7中Glu的数据（pK,1,-COOH 2.19，pK,2,-N,+,H,3,9.67，pK,R,R-COOH 4.25，pI 3.22）,绘出滴定曲线,指出Glu,-,和Glu,=,各一半时的pH值,指出Glu总是带正电荷的pH范围,指出Glu,和Glu,-,能作为缓冲液使用的pH范围,解：见图,Glu,-,和Glu,=,各50%时pH为9.67,pH3.22时 Glu总带正电荷,Glu,和Glu,-,缓冲范围pH4.25左右,五.氨基酸的一般物理性质,1.为无色晶体，熔点极高，一般在200以上。,2.一般无味，有的味甜有的味苦。,3.溶解度：水中差别很大，都溶于稀酸或稀碱中，一般不溶于有机溶剂。,五、,氨基酸的化学性质,（一）,-NH,2,参加的反应,1、与亚硝酸反应（室温，产生氮气,Van Slyke 即文司莱克法测定氨基氮的基础,2、,酰化反应（与酰基化试剂，酰氯或酸酐在碱性溶液中）,苄氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-cl),叔丁氧甲酰氯,对-甲苯磺酰氯,邻苯二甲酸酐,丹磺酰氯,多肽的人工合成中被用作氨基保护剂。,丹磺酰氯（DNS-cl，5二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽链NH,2,末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。,N GlyAlaSerLeuPhe C,DNSGlyAlaSerLeuPhe C,水解 DNSGly、Ala、Ser、Leu、Phe,DNS-AA在紫外光激发后发黄色荧光。,3、,烷基化反应,-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。,Sanger,反应,2.4一二硝基氟苯（DNFB）,DNP-氨基酸，黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH,2,末端氨基酸,Edman反应,苯异硫氰酸酯，PITC,苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），无色，可以用层析法分离鉴定。,被Edman用来鉴定多肽的NH,2,末端氨基酸,4、生成西佛碱的反应（Schiff）（与醛反应）,西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。,5、脱氨基反应,（二）,-羧基参加的反应,1.成盐、成酯反应 （与碱，醇反应）,2.成酰氯的反应,氨基被保护后，羧基可与二氯亚砜或五氯化磷反应，生成酰氯，使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。,3、脱羧基反应（生成一级胺，CO2),Glu脱羧形成-氨基丁酸,（三）,-NH,2,和-COOH共同参加的反应,1、,与茚三酮反应,茚三酮在弱酸中与-氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质（max=570nm）。,Pro、Hy-Pro与直接形成黄色化合物（max=440nm）,2、成肽反应,（四）,侧链R基参加的反应,用于蛋白质的化学修饰,1.含-OH基的氨基酸的酯化反应,2.,叠氮反应（又叫pauling反应）,（Tyr和His):与叠氮化合物对氨基苯磺酸反应生成棕红色化合物。红色和樱桃红色。,3.Cys的SH反应：1）.与重金属反应2）.与巯基保护基反应，碘乙酰胺，氯化苄等。3）.在蛋白质中生成胱氨酸。二硫健断裂用过甲酸或巯基乙醇，巯基乙酸。,（一）基于电荷性质差异的分离方法,六、,氨基酸的分离和分析,1、,电泳分离,电泳的基本原理:带电颗粒在电场中的移动。,电泳迁移率：p25,Glu、Leu、His、Lys，4种混合样，在pH6.0时，泳动方向及相对速度：p25,Glu Leu His Lys,pI 3.22 5.98 7.59 9.74,2、,离子交换柱层析,阳离子交换树脂：磺酸型阳离子交换树脂即强酸型和弱酸型(含-COOH)。,阴离子交换树脂：强碱型和弱碱型。,层析装置：p27，图312。洗脱剂，洗出液，样品。,分离原理：p26,图211。如PH=3时，氨基酸都带净正电荷。,氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力,氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用,（二）基于分配系数（极性）差异的分离方法,分配层析,分配定律：当一种溶质在两种互不相溶或几乎不互溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，它在两相中的浓度比值与它在这两种溶剂中的溶解度比值相等。这一比值是个常数称为分配系数。用f表示。,流动相和固定相。,f=流动相固定相=流动相中的溶解度固定相相中的溶解度,1、,纸层析,在流动相中分配系数越大，移动越快。Rf值,固定相：吸附水,流动相：丁醇、醋酸、水,分配系数,基本步骤：,点样、展层、现色、定性（定量）,2、薄层层析,支持剂：纤维素粉、硅胶、氧化铝粉,基本步骤：,铺板、点样、展层、现色、定性（定量）,3、分配柱层析,支持剂：纤维素、淀粉、硅胶,固定相：吸附水,流动相；即洗脱剂如苯酚、正丁醇等,固定相：涂有薄层液体的惰性颗粒,流动相：H,2,、N,2,、CO,2,前提：样品能汽化、热稳定,装置见沈同p154,（三）气液层析（气相层析、气相色谱）:gas-liquid chromatography.微量快速优点。,分配层析、离子交换层析,吸附层析,凝胶过滤层析,（四）高效液相层析（HPLC）:,high performance liquid chromatography,high presure liquid chromatography.快速，灵敏，高效。,特点：1.颗粒细表面积很大。2.高压，洗脱速度增大。装置见p154,第三节,蛋白质的一级结构 （共价结构）,一、,蛋白质结构层次,一级结构（共价结构）：又叫化学结构或初级结构,蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序(含二硫键)。肽健和二硫健。,二级结构：,多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。,超二级结构：,由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如、。,结构域：,大的球状蛋白分子中，多肽链形成几个紧密的球状构象，彼此以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由100-200个氨基酸残基构成。,三级结构：,整条,多肽链或亚基通过盘旋、折叠，形成紧密的、借各种次级键维持的球状构象。,四级结构：,寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。,单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。,二、,肽和肽键的结构,肽：,一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。,肽键：,氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），,肽单位：,酰胺平面，肽单位间以-C原子相隔，构成肽链,5肽,名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸,写法：Ser-Gly-Try-Ala-Leu或，,肽键的结构特点：,（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。,（2）肽键具有部分双键性质(C-N)，不能自由旋转。羰基双健具有部分单健性质,（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个C几乎处在同一平面内,（酰氨平面）,。,（4）肽键亚氨基在pH0-14内不解离和没有质子化倾向。,（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型,多肽链可以看成由C串联起来的无数个酰胺平面组成,Pro形成的肽链,三、,肽的重要性质,1、,旋光性,一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。,2、,肽的酸碱性质,短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。,肽的酸碱性质主要取决于端,和端COOH以及侧链上可解离的基团。,在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。,pH 优势离子的净电荷：,10.2 -2,等电点：PI=（4.5+7.8）/2=6.15,问题1：,求出二肽LysLys 及三肽LysLysLys的pI值。,问题2：,把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0?还是等于6.0？（小于6.0）,3、,肽的化学反应,肽的-羧基，-氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。,双缩脲反应,凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。条件：两个或两个以上的肽健的化合物与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或篮紫色复合物。,双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。,四、,天然存在的活性肽,1、,谷胱甘肽,GluCysGly,红细胞中的巯基缓冲剂。,参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。,2GSH GSSG,H,2,O,2,+2GSH 2H,2,O+GSSG,2、,短杆菌肽（抗生素）,由短杆菌产生的10肽环。抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。,L-OrnL-LeuD-PheL-ProL-ValL-OrnL-LeuD-Phe L-ProL-Val,3、,脑啡肽（,5,肽）,Met-脑啡肽：TyrGlyGlyPheMet,Leu-脑啡肽：TyrGlyGlyPheLeu,具有镇痛作用。,4、,肽类激素,五、蛋白质一级结构测定,（一）,蛋白质测序的基本策略,对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。,1、,直接法（测蛋白质的序列）,两种以上特异性裂解法,N,C,A 法裂解,A1,A2,A3,A4,B 法裂解,B1,B2,B3,B4,2、,间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）,（二）,蛋白质测序的一般步骤,（1）,测定蛋白质分子中多肽链的数目,（2）,拆分蛋白质分子中的多肽链。,（3）,断裂链内二硫键。,（4）分析多肽链的N末端和C末端。,（5）,测定多肽链的氨基酸组成。,（6）,多肽链部分裂解成肽段。,（7）,测定各个肽段的氨基酸顺序,（8）,确定肽段在多肽链中的顺序。,（9）,确定多肽链中二硫键的位置。,（三）,测序前的准备工作,1、,蛋白质的纯度鉴定,纯度97%以上，均一。,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带,DNScl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸,2、,测定分子量，,估算氨基酸残基数，确定肽链数 SDS-PAGE,凝胶过滤法,沉降系数法,3、,确定亚基种类及数目,根据分子量和N末端数,SDS-PAGE,4、拆分多肽链，并分别分离纯化,非共价键结合：8mol/L尿素，SDS-PAGE,二硫键结合：,过甲酸氧化：SS+HCOOOH SO,3,H,巯基乙醇还原,5、,测定氨基酸组成,酸水解的同时辅以碱水解。,确定肽链中各种aa出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。,6、,端基分析,N端分析,DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。,DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等,PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析，气液色普。氨基酸自动分析仪。20个以上的氨基酸。,氨肽酶法：外切酶。亮氨酸氨肽酶，焦谷氨酸氨肽酶。,C端分析,肼解法,无水肼NH,2,NH,2,100 5-10h。,苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中，可用层析法坚定。,Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。,羧肽酶法（Pro不能测）：外切酶,羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端aa,羧肽酶B：只水解Arg、Lys,N H,2,N ValSerGly C,图 P118 羧肽酶法测C末端,（四）,肽链的部分裂解和肽段的分离纯化,1、,化学裂解法,溴化氰 N MetX 产率85%,亚碘酰基苯甲酸 N TrpX 产率70-100%,NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）N XCys,羟胺NH,2,OH N AsnGly,Asn-Leu,Asn-Ala,约150个氨基酸出现一次,2、,酶法裂解,胰蛋白酶 N Lys X (X Pro),N Arg X,胰凝乳蛋白酶又叫糜蛋白酶 N TyrX (X Pro),NTrpX N PheX,胃蛋白酶(专一性差点，两侧都是疏水氨基酸）,Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu),Glu蛋白酶 GluX,Arg蛋白酶 ArgX,Lys蛋白酶 XLys,Pro蛋白酶 ProX,凝血酶(专一性强）N ArgGly,3、,肽段的分离纯化,电泳法 ,根据分子量大小分离,离子交换层析法（DEAECellulose、DEAESephadex）,根据肽段的电荷特性分离,反相法,根据肽段的极性分离,凝胶过滤,要求：单带,单峰,端单一（常用c l法）,（五）,肽段序列测定及肽链的拼接,1、Edman,法,（1）耦联,PITC H,NA-B-C-D,pH89，40,PTCA-B-C-D,（2）裂解,无水三氟乙酸（TFA）,ATZA +H,2,NB-C-D,（3）转化,PTHA,PTC肽：苯氨基硫甲酰肽,ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）,PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸,）,2、DNS-Edman,法,用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。,3、,有色,Edman,法,荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂。,4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4异硫氰酸酯。,4、,用自动序列分析仪测序,仪器原理：Edman法。,1967液相测序仪,自旋反应器，适于大肽段。,1971固相测序仪,表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。,1981气相测序仪,用Polybrene反应器。,（聚阳离子）四级铵盐聚合物,液相：5nmol 20-40肽 97%,气相：5pmol 60 肽 98%,6、,肽段拼接成肽链,16肽，端H 端,法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT,法裂解：SEO WTON VERL APS HO,重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS,（六）二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定,1、,二硫键的确定（对角线电泳法）,碘乙酰胺封闭-SH,胃蛋白酶水 解蛋白质,第一向电泳（PH6.5）,过甲酸氧化SS生成-SO,3,H,第二向电泳,分离出含二硫键的两条短肽，测序,与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。,2、,酰胺的确定,Asp Asn、Glu-Gln,酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn,举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu,+,Pro,0,Val,-,此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln,。,3、,糖、脂、磷酸基位置的确定,糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷,脂类：Ser、Thr、Cys,磷酸：Ser、Thr、His,经验性序列：,Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO,4,),Arg-Thr-Leu-Ser(PO,4,),Lys(Arg)Ala-Ser(PO,4,),六、,蛋白质的一级结构与生物功能,（一）,蛋白质的一级结构决定高级结构和功能,牛胰RNase变性一复性实验：,124个a.a残基,4个链内二硫键。,分子量：12600,(,8M尿素+硫基乙醇)变性、失活透析后构象恢复，,活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。,（二）,同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化,同源蛋白质：,在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。,如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。,同源蛋白质的特点：,同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）,有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。,除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。,多肽链长度相同或相近,通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。,亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。,1、,细胞色素,C,分子量：12500左右,氨基酸残基：100个左右，单链。,细胞色素C的不变残基35个。14，17两个Cys与血红素共价相连，18His,80Met与血红素配位健相连，48Tyr,59Trp与血红素氢健相连。,亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。,亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。,人与黑猩猩 0,人与猴 1,人与狗 10,人与酵母 44,2、,胰岛素,有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。,其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用。,猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,（三）,蛋白质一级结构的突变分子病,分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。,镰刀形红细胞贫血现象是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的,链第6位的aa残基由正常的Glu变成了疏水性的Val。人类有150多种。,正常人血红蛋白，.N.Glu 6,镰刀型贫血 .N.Val 6,生理条件下电荷：,Glu,-,Va1,0,亲水 疏水,治疗：用NaCN,KCN使氮末端Val氨基氨甲酰化。,（四）,一级结构的部分切除与蛋白质的激活,1、,血液凝固的机理,凝血因子（凝血酶原致活因子）,凝血酶原 凝血酶,纤维蛋白原A 纤维蛋白B,凝胶,（1）、,凝血酶原（糖蛋白）,在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274Thr275、Arg323Ile324断裂，释放出48个aa，产生活性凝血酶。,A链49 aa,B链259 aa,（2）、,纤维蛋白原,2,2,r,2,在凝血酶作用下，从二条链和二条链的N端各断裂一个特定的肽键-ArgGly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。,A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。,在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（,Gln,-,Lys,结合），生成交联的纤维蛋白。,2、胰岛素原的激活,前胰岛素原，含信号肽。,信号肽：蛋白质最初合成时在多肽链氮端含20个氨基酸残基左右的一段肽段，主要作用是指导新合成的蛋白质在细胞内的定向运输及定位。,胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。,活性胰岛素，高尔基体，切除C肽和四个碱性氨基酸。,七、多肽与蛋白质的人工合成,氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、苄氧酰氯（CBZ-Cl）、对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。,羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）,羧基活化：酰氯法（PCL5）、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法。,氨基活化：三乙胺,缩合剂：DCCI（二环己基碳二亚胺）直接接肽,多肽的固相合成,支持介质：聚苯乙烯树脂,合成方向：C端 N端。,合成程序：挂接去保护中和缩合断裂与去保护,第四节蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质,一、,多肽主链折叠的空间限制,从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。,但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。,因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转,1、,肽链的二面角,只有碳原子连接的两个键（CN和C-C）是单键，能自由旋转。,扭角:环绕CN键旋转的角度为,环绕CC键旋转的角度称。可旋转180度，一般呈顺时针旋转。旋转受H.O 原子以及R基的限制。多肽主链的构象可以用每个a-C的一对扭角来描述。,当()旋转键两侧的主链呈顺式时，规定()=0,从C沿键轴方向看，顺时针旋转的()角为正值，反之为负值。,2、,拉氏构象图：可允许的,和值,和同时为0的构象实际不存在,二面角（、）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。,C上的R基的大小与带电性影响和,拉氏构象图：,Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离（范德华距离），确定了哪些成对二面角（、）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以为横坐标，以为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。,实线封闭区域,一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。,虚线封闭区域,是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。,虚线外区域,是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。,二、,二级结构的基本类型,二级结构：,多肽主链中各个肽段借助于相邻氨基酸之间的氢键形成的构象。主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。,1、,螺旋,（1）、,螺旋的一般特征：,多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，,相邻的螺圈之间形成链内氢键,构成螺旋的每个C都取相同的二面角、。,典型的螺旋有如下特征：,二面角：=-57,=-48，是一种右手螺旋,每圈螺旋：3.6个aa残基，高度：0.54nm,每个残基绕轴旋转100，沿轴上升0.15nm,氨基酸残基侧链R基向外,相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。,肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成链内氢键。,典型的螺旋用3.6,13,表示，,3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基,13表示氢键封闭的环包括13个原子。,封闭环原子数=3n+4（n=1、2、.）（n：后边第n个aa）,2.2,7,螺旋（n=1）,3,10,螺旋（n=2）,3.6,13,螺旋（n=3）,4.3,16,螺旋（n=4）,2.2,7,3,10,3.6,13,4.3,16,n=1 n=2 n=3 n=4,（2）、,R,侧链对螺旋的影响,1 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。（电荷排斥不能形成氢健）,2 R基大（如Ile）不易形成螺旋,3 Pro即脯氨酸中止螺旋，产生一个结（不能形成氢健）。,4 R基较小，且不带电荷的氨基酸利于螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成螺旋。,（3）、,pH,对螺旋的影响(Glu,PI=3.22,Lys,PI=9.74),（4）、,右手,-,螺旋与左手,-,螺旋,右手螺旋比左手螺旋稳定。,蛋白质中的螺旋几乎都是右手,，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（+64、+42）。,（5）、,-,螺旋结构的旋光性,-螺旋结构是一种不对称的分子结构：,（1）碳原子的不对称性，,（2）构象本身的不对称性。,天然螺旋能引起偏振光右旋,-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。,2、,-,折叠,两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢健，这样的多肽构象就是-折叠片。,（1）氢键与肽链的长轴接近垂直。,（2）多肽主链呈锯齿状折叠构象,（3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。,（4）每个氨基酸残基位移3.5埃。,平行式：所有参与-折叠的肽链的N端在同一方向。a-角蛋白伸展后的-角蛋白。,反平行式：肽链的N端一顺一倒排列，N端间隔相同。蚕丝蛋白。反平-折叠比平行的更稳定。R基过大或带相同电荷也 不能形成-折叠片。,3、,-,转角（,-turn,）,也称-回折（reverse turn）、-弯曲（-bend）,球状蛋白质分子中出现的180回折，在回折角上就是,-,转角，,由第一个aa残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。,转角的特征：,由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。,主链骨架以180返回折叠。,第一个aa残基的C=O与第四个aa残基的N-H生成氢键,C,1,与C,4,之间距离小于0.7nm,多数由亲水氨基酸残基组成。Pro,Gly常出现在此结构中。常在蛋白质表面。,5、,无规卷曲,即无序结构,没有规律的多肽链主链骨架构象。,往往与生物活性有关。,-螺旋，-转角，-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的、二面角可存在于所有允许区域内。,三、,超二级结构,由若干个相邻的二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。,1、,复绕,-,螺旋（结构）,由两股或三股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋。,存在于-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。,2、,x,结构,两段平行式的-折叠通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。,c,x为无规卷曲,x为-螺旋，最常见的是，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。,3、,曲折（,-meander,）,由三条（以上）相邻的反平行式的-折叠链通过紧凑的-转角连接而形成的超二级结构。,4、,回形拓扑结构（希腊钥匙）,5、,-,折叠桶,由多条-折叠股构成的-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条-折叠股组成。,超氧化物歧化酶的-折叠筒由8条-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。,6、,-,螺旋,-,转角,-,-,螺旋,两个-螺旋通过一个转角连接在一起。,噬菌体的阻遏蛋白含此结构,四、,纤维状蛋白质,含大量的-螺旋，-折叠片，整个分子呈纤维状,广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。,1、,角蛋白,源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）。,-角蛋白，角蛋白。,（1）、,-,角蛋白（,外表皮以及毛发，指角等，哺动物中,）,主要由-螺旋结构组成,三股右手-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤维。,（2）、,-,角蛋白（丝心蛋白，鸟及爬行动物）,以-折叠结构为主。,片层结构：反平行式-折叠片以平行的方式堆积。,链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。,2、,胶原蛋白,（脊椎动物中）：含羟脯氨酸和羟赖氨酸，基本单位是原胶原蛋白分子（由三