细菌和噬菌体的重组和连锁.ppt

单击以编辑,母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 细菌和噬菌体的重组和连锁,细菌和病毒在遗传学研究中的优越性,*结构简单,*,世代周期短,*容易检出突变,第一节 细菌的遗传分析,一、细菌的杂交,细菌菌落的表现型：,原养型（野生型）,形态性状：菌落形状、颜色、大小,突变型,生理特性 营养缺陷型,+/-,抗性,-,抗药或抗感染,r/s,图,5,1,黎德伯格和塔特姆的杂交试验,1946,可能的原因：,*污染,*突变,*营养互补,*遗传重组,图,5-2 U,型管实验证明菌株间直接接触的必要性,二、,F,因子,大肠杆菌遗传物质的传递方式跟具有典型,减数分裂过程的生物不同,:,*,两个亲本类型对子裔的遗传贡献不相等,*所有在子裔中出现的基因都是连锁的,?,Hayes,和,Cavalli-Sforza,（,1952),菌株,A,菌株,B,met,-,thr,+,leu,+,thi,+,met,+,thr,-,leu,-,thi,-,链霉素处理菌株,A,或菌株,B,，阻碍其分裂,处理菌株,A+,未处理菌株,B,有菌落,处理菌株,B+,未处理菌株,A,无菌落,菌株,A,供体,处理后仍能转移基因,菌株,B,受体,未处理，仍能分裂，接受转移过来的基因,供体有一个性因子即致育因子,(sex or fertility,factor)-,F,因子,，是能独立增殖的环状,DNA,分子,供体细胞,F,+,的表面有性伞毛,图,5,3,两个,E.Coli,细胞杂交的电子显微镜照片,(X 34,300),性伞毛,/,结合管,F,+,F,+,F,-,F,-,F,+,F,-,F,+,但染色体上基因的重组频率很低,吖黄素,F,+,F,-,5,F,+,F,-,Fig 17.9 F+x F-conjugation.,2003 John Wiley and Sons Publishers,三、高频重组,在菌株,A,（,F,+,）中发现一个新菌株，跟菌株,B,（,F,-,）杂交时，出现重组子的频率很高，几乎,比,F,+,F,-,高一千倍，称高频重组,（,high frequency of recombination,Hfr,）菌株,但,Hfr,F,-,时，,F,-,细菌很少有转变成,F,+,的？,四、用中断杂交技术作连锁图,Jacob,和,Wollman,在五十年代设计了一个著名的,中断杂交试验,Hfr:thr,+,leu,+,azi,r,ton,r,lac,+,gal,+,str,s,F,-,:thr,-,leu,-,azi,s,ton,s,lac,-,gal,-,str,r,每隔一定时间取样，放在食物搅拌器内搅拌,培养在含,str,不含,Thr,和,Leu,的培养基上，,Hfr,和,F,-,不能生长，只有重组子可以生长,用影印培养法测试形成的菌落的基因型，,确定每个基因转入,F,-,的顺序（时间）,根据基因转入,F,-,的时间，进行细菌染色体作图,细菌的影印培养法,中断杂交技术,（,interrupted mating technique,）：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术,Hfr,的未选择标记基因进入,F,-,所需的时间,分钟 转移的,Hfr,基因,9 0,9 azi,r,11 azi,r,ton,r,18 azi,r,ton,r,lac,+,25,azi,r,ton,r,lac,+,gal,+,Hfr,细菌的基因按一定的时间顺序依次出现,在,F,-,细菌,染色体从一端（原点,origin,，,o,）开始，以,线性方式进入,F,-,细菌,o azi ton lac gal F,0 9 11 18 25,根据中断杂交实验作出的大肠杆菌连锁图,Fig 17.12 The interrupted mating experiment of Wollman and Jacob.,2003 John Wiley and Sons Publishers,高频转导：,Hfr,x F-,F,因子部分在最后转移,Hfr,的,类型,基 因 转 移 顺 序,HfrH,1,2,3,AB312,0 thr pro lac pur gal his gly thi,0 thr thi gly his gal pur lac pro,0 pro thr thi gly his gal pur lac,0 pur lac pro thr thi gly his gal,0 thi thr pro lac pur gal his gly,表,5,1,用中断杂交法确定的几个,Hfr,菌株的基因顺序,用不同的,Hfr,菌株进行中断杂交实验制作,连锁图，发现,基因转移的顺序、,转移的起点,(O),和,转移的方向不同？,假设细菌染色体是环状的,任何线性的,Hfr,染色体的形成都可用,F,因,子插入环状染色体的不同地点来说明,Cairns J.1960,电子显微镜观察到大肠杆菌的,DNA,确实是环状的,Fig 17.10 Some of the sites of F-factor integration in the,E.coli,chromosome.,2003 John Wiley and Sons Publishers,五、,F,因子整合到细菌染色体,环状的,F,因子,，通过一个简单交换，整合到,环状的细菌染色体上，形成,Hfr,染色体,F,因子,的插入决定了,Hfr,染色体的极性，,F,因,子,所在的地方是末端，而跟,F,因子,相对的一,点是原点，是染色体转移的起点,环状的,F,因子,包括几个部分：,1,）原点，是转移的起点,2,）形成性伞毛的基因群,3,）,DNA,复制酶基因,4,）插入序列,质粒,（,plasmid,）：染色体外遗传物质，,可自我复制，并在细胞分裂时分配到子,细胞中，如,可整合到染色体上，成为染色体的一部,分，则称为,附加体,（,episome,）,F,因子,在,F,+,细菌中存在于细胞质内，在,Hfr,细,菌中整合到染色体上，是附加体的一种,F,因子的结构及其整合到细菌染色体的过程,Hfr,F,-,Hfr,Hfr,F,-,F,-,接合开始，,F,因子仅有一部分进入,F,细胞，剩下部分基因只有等到细菌染色体全部进入到,F,细胞之后才能进入，然而转移过程常常中断,5,E.coli,F,因子存在状态有三种类型：,没有,F,因子，即,F,游离状态的,F,因子，即,F,+,整合的,F,因子，即,Hfr,六、细菌的交换过程,根据杂交中产生的重组子推论出杂交中遗,传信息的转移过程,转移过去的基因必须通过一种交换过程整,合到细菌的基因组？,真核类 遗传交换在两整套基因组间进行,原核类 一套完整的基因组（,F,-,内基因子，,endogenote,）,一不完整的基因组（供体外基因子，,exogenote,）,即在部分二倍体（,partial diploid,）或,部分合子（,merozygote,）间进行,细菌重组的两个特点：,1,）只有偶数交换才能产生平衡的重组子,2,）相反的重组子（,reciprocal recombinant,）,不出现，所以在选择培养基上只出现一种,重组子,七、重组作图,如果两个基因间的转移时间小于,2,分钟，用,中断杂交法所得的图距不太可靠，应采用,传统的重组作图法。,例如根据中断杂交知道,lac,和,ade,紧密连锁,而且,ade,是,lac,之后进入,F-,受体,做杂交,:,Hfr lac,+,ade,+,str,s,F,-,lac,-,ade,-,str,r,混合,60min,后在含有链霉素的基本培养基上培养,Hfr,和,F,-,不能生长,生长的应为,ade,+,str,r,因为,ade,+,是在,lac,+,之后进入,F,-,的,lac,+,自然也已进入,影印培养检测能否利用乳糖,如为,lac,+,ade,+,没有发生交换,;,如为,lac,-,ade,+,发生过交换,lac-ade,之间的图距为：,lac-ade=,lac,-,ade,+,lac,-,ade,+,+lac,+,ade,+,x100,1,、,选择在腺甘酸（,ade,）缺乏的培养基上生长的类型。它们表明,ade,基因已转入细胞。,2,、,选出的,lac,-,ade,+,类型即是重组子，因为,ade,+,已进入，表明,lac,+,也已进入，而,lac,-,ade,+,表型就是供体受体,lac,、,ade,两个基因间发生交换的结果。可用此来计算重组值,。,重组作图：,Hfr lac+ade+,F-lac-ade-,F-lac-ade-,Hfr lac+ade+,F-lac-ade-,F-lac+ade+,Hfr lac+ade+,F-lac-ade-,F-lac-ade+,没有发,生交换,两个基因都交换到受体上,交换发生在两个基因之间,1,个时间单位,(1,分钟,)20%,重组值,图,5,4 1963,年,E.Coli,遗传图。图距单位是分钟,八、性导,Adelberg 1959,发现一个新的,Hfr,菌株,:,*,性因子转移频率似乎与,F,+,一样高,*与,Hfr,一样，以同一方向和顺序转移细菌染色体，但效率要低得多,Hfr F Hfr,F,（,F-prime,）,Fig 17.11 The formation of an F factor.,2003 John Wiley and Sons Publishers,F,上的基因与细菌染色体的基因形成了,部分二倍体,利用,F,因子形成部分二倍体的过程，,称为,性导,（,sexduction,或,F-duction,）,F,因子整合到宿主细菌染色体的,过程是可逆的，当发生环出时,偶然不够准确，携带有染色体,的一些基因，称这种,F,因子为,F,因子,可独立复制，也可重新整合到,宿主染色体上形成,Hfr,九、转化,转化,（,transformation,）：某些细菌,(,或其它生物,),通过其细胞膜直接从周围介质中吸收,DNA,片段,转化首先是,Griffith(1928),在肺炎双球菌中发现的,杀死,S,片段,R S,Avery(1944),等研究证实，转化因子是,DNA,。,这个极其重要的发现，不仅证实遗传物质是,DNA,，而且表明转化是细菌交换基因的方式之一,Fig 17.2 The integration of a circular donor DNA molecule into a circular recipient chromosome requires a single crossover event.,2003 John Wiley and Sons Publishers,Fig 17.1 In order for successful recombination to occur,an even number of exchanges,two in this case,is required between the circular main chromosome and the linear fragments.,2003 John Wiley and Sons Publishers,Fig 17.15 A single exchange between a linear donor DNA molecule and a circular recipient chromosome does not yield a structurally intact recombinant chromosome.,2003 John Wiley and Sons Publishers,Fig 17.6 Bacterial transformation.,2003 John Wiley and Sons Publishers,转化和基因重组作图,当两个基因紧密连锁时，它们就有较多的,机会包括在同一个,DNA,片段中，并同时,整合到受体染色体中。因此，紧密连锁的,基因可以通过转化进行作图。如：,表,5-2,枯草杆菌细胞的转化,供体,DNA,受体细胞 转化子类型 转化子数,trp,+,tyr,-,trp,+,tyr,-190,trp,-,tyr,+,trp,-,tyr,-,trp,-,tyr,+256,trp,+,tyr,+2,trp,+,tyr,+,trp,-,tyr,-,trp,+,tyr,-196,trp,-,tyr,+328,trp,+,tyr,+367,*,2,个转化,DNA,分子产生的结果中，双转化,类型极少,两个分离的转化,DNA,片段同时与受体重组,是困难的,*,trp,+,tyr,+,的转化中，双转化类型明显增加,这两个基因是连锁的：相距越远，越容易,获得单转化；越近，越容易获得双转化,trp-tyr,重组率,=,（,196+328,）,/,（,196+328+367,）,=58.8%,小结,接合,：指在原核生物中，遗传物质从,供体,-,“,雄性,”,转移到受体,-,“,雌性,”,的过程,性导,：指接合时由,F,因子所携带的外源,DNA,转移到细菌染色体的过程,转化,：某些细菌,(,或其它生物,),通过其细胞,膜直接从周围介质中吸收,DNA,片段,第二节 噬菌体的遗传分析,一、烈性噬菌体,二、,T,2,噬菌体的基因重组与作图,噬菌斑形态 正常,r+,:,小,、,边缘模糊,噬菌体,突变,r-,:,大,、,边缘清楚,性状,宿主范围：感染和裂,正常,h,+,:B,株,解的菌株,突变,h,-,:B,株,不同,或,B/2,株,由于,h,和,h,+,均能感染,B,株，用,T,2,的两亲本,h,r,+,和,h,+,r,同时感染,B,株，称为,双重感染,h,-,r,+,h,+,r,-,B,株,h,-,r,+,h,+,r,-,h,-,r,-,h,+,r,+,接种在同时长有,B,株及,B/2,株的培养基上,亲型噬菌斑,h,-,r,+,：透明、小,h,+,r,-,：半透明、大,重组型噬菌斑,h,-,r,-,：透明、大,h,+,r,+,：半透明、小,重组型噬菌斑,重组值,=,100%,总噬菌斑,h,-,r,-,+h,+,r,+,=,100%,h,-,r,+,+h,+,r,-,+h,-,r,-,+h,+,r,+,r,a,h,+,r,+,h,24%,r,b,h,+,r,+,h,12.3%,r,c,h,+,r,+,h,1.6%,表,5,2,四种噬菌斑数及重组值,杂交组合,每 种 基 因 型 的,%,重 组 值,r,h,+,r,+,h,r,+,h,+,r,h,r,a,h,+,r,+,h,r,b,h,+,r,+,h,r,c,h,+,r,+,h,34.0,32.0,39.0,42.0,56.0,59.0,12.0,5.9,0.7,12.0,6.4,0.9,24%,12.3%,1.6%,分别,作出,r,a,、,r,b,、,r,c,与,h,的连锁图,r,a,24,h,r,b,12.3,h,r,c,1.6,h,r,a,r,b,r,c,h,r,a,r,b,h r,c,r,a,r,c,h r,b,r,a,h r,c,r,b,为了确定基因排列顺序，可先只考虑,r,b,、,r,c,及,h,来确定是,r,b,r,c,h,还是,r,b,hr,c,。,为此作：,r,b,+,r,c,-,r,b,-,r,c,+,重组值约,14%,可知,h,应位于,r,b,及,r,c,之间，又因为,T,2,噬菌,体的连锁图是环状的,三、温和噬菌体（溶源性细菌）,噬菌体感染细菌后，除偶尔情况外，不出现溶菌现象，这一类噬菌体被称为,温和性噬菌体,（,temperate phage,）,以两种形式出现，如,P,1,以游离状态存在,以整合状态存在,Fig 17.18 The establishment of lysogeny.,2003 John Wiley and Sons Publishers,细菌受温和噬菌体感染后进入溶源周期,具有如下两个特征,:,*,具有免疫性,*受紫外线诱导进入裂解周期,有些细菌带有某种噬菌体，但并不立,即导致溶菌，这种现象称为,溶源性,（,lysogeny,），,而这样的细菌称为,溶源性细菌,或,溶源菌,（,lysogenic bacteria,）,Lederberg,等所用的原始大肠杆菌菌株对于,温,和噬菌体来说是溶源菌，发现,F,+,F,-,(),可偶,尔产生溶源性重组子；而,F,+,(),F,-,则几乎不,产生溶源性重组子,HfrF,-,(),很容易得到有,Hfr,基因的,溶源性重组子,Hfr,(),F,-,时,Hfr,菌株的前端基因可在,F,-,受体中出,现，但后端基因的重组子得不到？,原噬菌体进入一个无免疫能力的细,胞，原噬菌体随即开始复制，使细胞,裂解，释放出游离的噬菌体，这种现,象叫做,合子诱导,（,zygotic induction,）,原噬菌体,?,时间进入,F,-,细菌,通过中断杂交试验,可以证明，,原噬菌,体在一特定时间进入,F,-,细菌，表明在,gal,座位的附近,四、转导,在大肠杆菌中发现细菌杂交，,在鼠伤寒沙门氏菌？,phe,-,try,-,tyr,-,met,-,his,-,在基本培养基上分别培养 无菌落,混合培养 有菌落,？,U,型管试验,将上述两种菌株分别放在戴维斯,U,型管的两臂内,中间用玻璃滤板隔开，以防止细胞直接接触，但,允许比细菌小的物质通过，获得了野生型重组体,说明不是接合,这种重组是通过一种过滤性因子,(FA),而实现的,FA,不受,DNA,酶的影响,说明不是转化,进一步研究证明，,FA,是一种噬菌体，,称为,P,22,（用抗,P,22,血清处理后失活）,转导,（,transduction,）：以噬菌体为载,体，将供体菌基因转移到受体菌中的,过程。,普遍性转导,转导,特异性转导,1,、普遍性转导,可以转导细菌染色体组的任何不同部分,转导颗粒,P,22,或,P,1,感染细菌细胞时，细菌染色体断裂,成小片段。在形成噬菌体颗粒时，偶尔错,误地把细菌染色体的片段组合到头部,影响感染细菌的能力？,不影响 外壳蛋白,吸附到细菌细胞，注入内容物,供体菌,DNA,受体菌,DNA,Fig 17.17 The formation of generalized transducing viruses and the subsequent transduction of recipient bacteria.,2003 John Wiley and Sons Publishers,两个基因同在一起转导就是共转导,或并发转导（,cotransduction,）,共转导的频率高，表明两个基因,在染色体上的距离,愈近，连锁愈紧密,测定两基因的共转导频率就,可以确定基因之间的次序和距离,P,1,基因组,91.5kb,约相当于大肠杆菌基因组的,2.4%,两个基因并发转导的概率可用下式计算,X=(1-d/L),3,其中,d,为两标记基因之间的距离,L,为转导颗粒能够包裹的,DNA,的最大长度,例：用,P,1,噬菌体进行转导实验,供体,thr,+,leu,+,azi,r,受体,thr,-,leu,-,azi,s,在受体中选择一个或几个供体的标记,基因，然后检查非选择性标记基因的,有无,表,5-3,用,P1,噬菌体普遍性转导测定大肠杆菌基因间的连锁关系,实验 选择标记 非选择标记,1,leu,+,50%azi,r,，,2%thr,+,2 thr,+,3%leu,+,，,0%azi,r,3 leu,+,thr,+,0%azi,r,实验,1,说明,leu,和,azi,相近,而,leu,和,thr,则远,thr azi leu,thr leu azi,实验,2,说明,leu,比,azi,更接近,thr,thr leu azi,实验,3,说明这个顺序是正确的，因为,leu,+,thr,+,片段从未携带有,azi,r,这也说明了转导片段的大小。在,thr,和,leu,之间的,DNA,长度已接近于,这个片段大小的极限,2,、特异性转导,Morse,和,Lederberg 1956,发现,噬菌体也可以转移细菌基因，但被转导的只是,噬菌体在细菌染色体上插入位点两侧的基因，即仅限于,gal,和,bio,区以内的基因，称,特异性转导,(specialized transduction),，或,局限性转导,（,restricted transduction),图,5,4dgal,特异性转导噬菌体的形成模式,*,带有,gal,+,的,噬菌体是有缺陷的，记作,d,gal,+,（,-defective,gal,+,）,*,d,gal,+,转导粒子（,transducing particles,）,约丧失,25%,的噬菌体染色体，但具有完整,的,外壳，仍能感染细菌,Fig 17.20 The mechanism of specialized transduction by bacteriophage.,2003 John Wiley and Sons Publishers,图,5,5dgal,+,转导颗粒转导,gal,细菌的过程,E.coli,phage,gal,dgal+,非正常,切离,感染,gal-,E.coli,gal-,gal+,gal-,d,gal+,若,dgal+,进入的同时，也感染进去,双重溶源菌形成,双重溶源菌的形成,高频转导,用紫外线诱导双重溶源菌，会产生约一半的,dgal,+,转导噬菌体，,这是因为通过正常的切离就可以从每一个细,菌得到一个,正常,噬菌体和一个,转导噬菌体，,而且由于有正常的存在，有缺陷的,dgal,也,能由于功能上得到补偿而复制。用,双重溶源,菌进行的转导称,高频转导,（,high-frequency transduction,，,HFT,）,而单纯的转导噬菌体转导频率只有,10,-6,小结,普遍性转导：,phage,整合的位置不固定，,染色体上的基因都可以被其转导。,如,P,22,phage.,局限性转导：,phage,经常插到特定的基因旁，,转导该位点附近的基因。,如,phage,.,应用中断,杂交技术,、重组作,图、转化,和转导相,结合的方,法已经得,到细菌的,非常详细,的染色体,图,遗传学规律的普遍性,细菌有类似于性过程的现象,细菌和病毒的基因连锁和基因重组,遗传规律在微生物和高等生物中的,一致性,习 题,1,、一个基因型为,a,+,b,+,c,+,d,+,e,+,并对链霉素敏感的,E.coli,Hfr,菌株，与基因型为,a,-,b,-,c,-,d,-,e,-,并对链霉素耐性的,F,-,菌株接合，,30min,后,，用链霉素处理，然后从成活的受体中选出,e,+,原养型，发现它们的其它野生型（,+,）基因频率如下：,a,+,70%,、,b,+,0%,、,c,+,85%,、,d,+,10%,。问,a,、,b,、,c,、,d,与供体染色体起点（原点,O,）相对位置,如何？,b d a c e,O,2,、当用基因型为,ACNRX,的菌株作为原始的,DNA,来转化一个基因型为,acnrx,的菌株，这里，基因顺序是未知的。发现如下子代菌株：除,AcnRx,、,acNrX,、,aCnRx,和,AcnrX,，还有单个基因转化的类型,aCnrx,。问这些基因的顺序如何？,NXARC,3,、用一般性转导噬菌体对细菌的,3,个基因作图，宿主细胞是,a,+,bc,+,。转导噬菌体感染这个细胞，裂解释放后，再感染,ab,+,c,细胞。获得各基因型细胞如下：,a,+,b,+,c 3%,；,a,+,bc,+,46%,；,a,+,b,+,c,+,27%,；,abc,+,1%,；,a,+,bc 23%,假定,abc,总是共转导，三基因顺序及图距如何？,根据,abc,+,1%,确定,3,个基因的排列顺序为,bac,。,Rf,(a-b),=3%+27%+1%=31%,Rf,(a-c),=3%+1%+23%=27%,31 27,b a c,