双向电泳原理与流程.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,/,GE /,*,万 翔,Xiang.wan,18675966958,双 向 电 泳 技 术,Proteomics,“.,the analysis of,complete complement of proteins,.Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins,but also the determination of their localization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,their function.,Stanley Fields,University of Washington,Seattle,in,Science,291,1221(2001),Proteomics,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(,proteome),仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象,因为蛋白质才是生命活动的真正执行者,从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象;此外并不是细胞内的所有的,DNA,都翻译转录成蛋白质,Proteome Analysis and Proteomics,The analysis of the entire PROTEin complement expressed by a genOME,or by a cell or tissue type.,Wasinger VC et al,Electrophoresis 16(1995),“Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery,diagnostics and therapy.”,Two basic technologies:,2-D electrophoresis of complex protein mixtures,Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods,Why 2DE?,Only“Proteomics”is the large-scale screening of the proteins of a cell,organism or biological fluid,a process which requires stringently controlled steps of sample preparation,2-D electrophoresis,image detection and analysis,spot identification,and database searches.,The core technology of proteomics is 2-DE.,At present,there is no other technique that is capable of simultaneously resolving,thousands of proteins,in one separation procedure.,理论,pI and M,r,图,酵母细胞表达6,216种蛋白,pI(,理论值,),M,r,kDa,2DE,工作范围,注:图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性,至今1,484个蛋白被鉴定,(Nat.Biotechnol.17,676 and 19,242),From:,Wildgruber et al.Electrophoresis,21,(2000)2610-2616,.,寻找差异蛋白质,环孢素,A,处理前,环孢素,A,处理后,正常 组织,肿瘤组织,细胞,组织,Life Sciences,的历史,LKB,电泳发明者,Pharmacia,层析技术开创者,Amersham Biosciences,提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案,GE Healthcare Life Sciences,实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破,GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis,LKB introduced,Ampholine,the first commercial carrier ampholyte,The first multiple separation system,ISO-DALT,was developed,Pharmacia Fine Chemicals introduced,Pharmalyte,LKB introduced,Immobiline,Pharmacia Biotech introduced,Immobiline DryStrip,Pharmacia Biotech introduced,ImageMaster,suite,Pharmacia Biotech introduced,IPGphor,Pharmacia Biotech launched,DALT II,system,Amersham Pharmacia Biotech launched,Typhoon,Amersham Biosciences launched,Ettan DIGE,The,Multiphor,flatbed electrophoresis unit is launched.In production for 30 years in 2003!,1967,1978,1979,1982,1991,1993,1998,2000,2000,2002,1973,Image analysis,Image acquisition,Automated spot picking,Spot digestion,MALDI target spotting,LWS Laboratory workflow system,MALDI-ToF,Protein Separation,Proteomics 2DE Workflow,Sample Prep,Sample labeling,小鼠肝脏蛋白提取物2,D,凝胶电泳,2-,D electrophoresis gel,from Prof.Dr.A.Grg,Technical University,Munich,Germany,2D/MS,经典工作流程,细胞裂解,匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,差异分析,双向电泳,第一向,第二向,图像获取,图谱分析,银染,考染,荧光,蛋白标记,样品制备,分离,染色,图谱分析,挖点,酶解,点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,样品制备,细胞破碎,蛋白沉淀,溶解,抑制蛋白酶活性,去除,核酸,脂类,盐，缓冲液，离子性小分子,不溶性物质,2D/MS,经典工作流程,差异分析,图像获取,图谱分析,银染,考染,荧光,蛋白标记,染色,图谱分析,挖点,酶解,点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,Separation,双向电泳,第一向,第二向,细胞裂解,匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,样品制备,Principle of 2-D Electrophoresis,1.,First dimension:,denaturing isoelectric focusingseparation according to the,isoelectric point,2.Second dimension:,SDS electrophoresisseparation according to the,molecular weight,2-D electrophoresis resolves a few thousand protein spots.,等电聚焦电泳原理,蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。,等电聚焦（,IEF）,电泳就是在凝胶中加入两性电解质，从而构成从正极到负极,pH,逐渐增加的,pH,梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的,pH,值，便可以得到它的等电点。,等电聚焦电泳原理,双向电泳：传统方法,sample,胶在,SDS,缓,冲液中平衡,Principle according to P.H.OFarrell and J.Klose(1975),pH 10,pH 10,pH 3,pH 3,垂直胶管中进,行等电聚焦,urea,NP-40,一向:,二向,:,SDS,丙烯酰胺凝胶电泳,非连续梯度胶,按等电点分离（电荷）,按分子量分离（质量）,使用载体两性电解质,IEF,时存在的问题,不同批次载体两性电解质的重现性,载体两性电解质梯度不稳定,蛋白载量有限,重现性差导致梯度漂移,梯度漂移导致酸性和碱性蛋白质丢失,管胶柔软，尺寸不定,操作者个人技术影响结果,固相凝胶,(,支持膜上,0.5 mm,厚凝胶,),丙烯酰胺缓冲液:,Immobiline,CH,2,=CH-CO-NH-R,R：,羧基或叔胺基,固相,pH,梯度,(IPG),Immobiline,干胶条的特性,可重复性,无梯度漂移,真正的平衡方法,可分离酸性和碱性蛋白,容纳蛋白样本量更多,水平和垂直,SDS,凝胶中都能使用,允许样本水化上样,机械强度和尺寸稳定,易操作,易于对样本跟踪标记,新,pH,范围的,Immobiline,干胶条,高分辨率的,IPG,胶条，联合使用,DeStreak,试剂,能改善,极碱性区域,蛋白点结果,。,归功于独特的试剂。,使用,pH,范围相互重叠的干胶条，可提高,2-D,图谱,分析效率,!,新,pH,范围:,Immobiline,DryStrip,pH 3 5.6 NL,Immobiline,DryStrip,pH 5.3 6.5,Immobiline,DryStrip,pH 6.2 7.5,Immobiline,DryStrip,pH 7 11 NL,Immobiline,DryStrip,pH 3 11 NL,不同,pH,范围胶条,不同长度、多种窄,pH,范围胶条可选，尤其是1个,pH,范围,pH7-11NL,碱性胶条,宽,pH,、窄,pH,范围胶条,宽,pH,梯度胶条应用,:,整个蛋白图谱,窄,pH,梯度胶条应用,:,提高分辨率,增加样品上样量,检测分析更多蛋白,pH 3,4,5,6,7,8,9,10,4,5,6,7,8,9,提高分辨率,:,斑点显现,IPG 4-7,IPG 5-6,IPG 4-7,IPG 5.5-6.7,Mouse liver proteins,From A.Grg et al.(1999),不同长度的胶条,7,cm 11 cm 13 cm 18 cm,24cm,线形与非线形胶条,for most samples,Cell lysates,Tissue extracts,linear(L),nonlinear(NL),for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7,Serum proteins,pH 3-10 L and NL,from Prof.Angelika Grg,Technical University Munich,Tissue Proteins from Mouse Liver,linear(L),nonlinear(NL),The IPGphor,Platform,IPG,胶条 水化,IPG strip rehydration,如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积,加样品到胶条槽,泡涨盘,VS,聚焦盘,干胶条的水化,主动水化：胶条槽内进行，大分子蛋白更容易进入胶条；,30,120V,，,10,24Hrs,被动水化：专用水化盒中进行,NEW,！,无需覆盖油！,避免灰尘污染，空气作用,不透明盖子，适用于,CyDye,DIGE,标记,同时适用于市场上所有,7,24cm,干胶条的水化,在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。,上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样150,l,。,盖上胶条槽的盖子，再盖,IPGphor,仪器的盖子。,分别将两个,IEF,电极片放在,IPG,胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。,样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的,IPG,胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置.,杯上样&纸桥上样,IEF,电泳,IPGphor,包括半导体温控系统(20,C),和程序化电源(10000,V),可同时进行12根胶条的等电聚焦,聚焦效果以“,Vh,”,数控制，可提高重复性,IPG,胶条的平衡两步平衡,SDS,电泳前,平衡母液,:,2%SDS,50mM,Tris,-,HCl,pH 8.8,6M urea,30%glycerol+,蛋白与,SDS,结合,甘油和尿素降低电内渗作用,第一步,DTT,平衡,：,(1 x 15min)1%DTT,第二步,碘乙酰胺平衡,：去除多余的,DTT，,防止拖尾,(1 x 15min)2.5%,iodoacetamide,第二向垂直电泳系统,琼脂糖覆盖密封,放置,IPG strip,低熔点琼脂糖,Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface,Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose,Inserting the Cassette,SDS-PAGE,参数,SE600ruby,Ettan DALT,six,Ettan DALT,twelve,system,第二向系统,stripgelnumberrunning,length(cm)size(cm)of gelstime(hr),Ettan Dalt12,18,2425 x 20124.5,Ettan Dalt6,18,2425 x 20 64.5,SE 600,2 x 7,1314 x 16(24)44,MiniVE,78 x 7,8 x10 21.5,Multiphor II,7,1124 x 11*11.5,1824 x 18 13.3,PhastSystem,(4)*4 x 4 20.5,*2 or 3 strips side-by-side,*cut or home-made strip,2D/MS,经典工作流程,差异分析,图像获取,图谱分析,蛋白标记,图谱分析,挖点,酶解,点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解,匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,样品制备,双向电泳,第一向,第二向,银染,考染,荧光,染色,Protein Detection Methods,Coomassie Blue-,考马斯亮蓝染色,+灵敏度,，,低至0.01,m,g(“,胶体”考染,),+,非特异性染色,+,染料与蛋白成比例结合,+,线性化好,扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度,纯度不够,有限的动力学范围,胶体考马斯亮蓝染色,1,mg E.coli strain B,IPGphor 24 cm pH 4-7,Colloidal CBBG250 staining,银染,+灵敏度，低至0.2,ng,+,在凝胶基质中与蛋白交联,+,自动催化反应,染凝胶表面蛋白,线性化程度比考染低,一些大分子物质也被染色,步骤多，某些步骤时间控制严格,Silver stained gel of E.coli Lysate,IPG 4-7,Silver stained,with,PlusOneKit,without,glutaraldehyde,and,formaldehyde,in the Ag sol.,2D/MS,经典工作流程,差异分析,蛋白标记,挖点,酶解,点靶,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解,匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,样品制备,双向电泳,第一向,第二向,图像获取,图谱分析,银染,考染,荧光,染色,图谱分析,ImageScanner III,图像扫描系统,灰度校正功能,平台具有防水功能,，可直接扫描,SDS-PAGE,湿胶。,3.7,OD,高动态范围，保证高、低丰度蛋白的准确定量。,扫描平台大，,A3,扫描面积,，,一次可扫描,2块,24,cm,凝胶。,Gray 256 scale,Transmissive,300dpi,由,SIB,GeneBio,和,GE Healthcare,合作开发，为,SwissProt,推荐分析软件。,高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计算方法，不受背景影响。,在原始数据上进行分析，结果可靠。界面窗口可随意设计，界面极其友好。,全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据点的相关因素、形状、位置、周围情况，胶间匹配效率高。,多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白表达差异。,可直接链接到,ExPASy,和,SwissProt,数据库，进行网上检索。,全部操作过程都可以撤销/重作操作，每一步骤都附有说明，使用方便。,全面支持,DIGE,技术，源自,DeCyder 2D,软件。,ImageMaster 2D,双向电泳分析软件,ImageMaster Platinum 7.0,软件分析流程,2D/MS,经典工作流程,差异分析,蛋白标记,蛋白鉴定,体液,植物,微生物,组织,细胞,分离,细胞裂解,匀浆,预分级,除杂质,浓缩,定量,样品制备,双向电泳,第一向,第二向,图像获取,图谱分析,银染,考染,荧光,染色,挖胶,图谱分析,自动斑点切取,Spot picker,切点针头,胶盘,MALDI-ToF,质谱分析,标记荧光,全自动,软件分析,自动切点,图像采集,双向电泳分离,自动酶解,蛋白质组学完整平台,样品制备,蛋白纯化,蛋白质组学完整平台,经典 2,D,工作流,:,产品范围,Grinding kit,2-D Clean-Up kit,Mini dialysis kits,2-D Quant kit,2-D Fractionation kit,Albumin&IgG removal kit,Ettan IPGphor,Immobiline DryStrip,Ettan DALT,twelve,Ettan DALT,six,DALT gel 12.5,ImageMaster,DeCyder 2D,蛋白标记,样品制备,分离,染色,图谱分析,挖点,酶解,点靶,体液,植物,微生物,组织,细胞,Ettan Spot Picker,Ettan Digester,Ettan Spotter,Ettan Spot Handling Workstation,Deep Purple Total Protein Stain,PlusOne Silver Staining Kit,protein,CyDye DIGE Fluors,Thank you!,Any Questions.,