液相色谱的方法开发分离机理及色谱柱.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,液相色谱的方法开发,分离机理及色谱柱,选HPLC参数时的基本考虑,溶解度-选择流动相的条件,分子量-在样品预处理或GPC分析时有用,官能团-有否离子化基团?保留特性如何?,样品的基质-考虑如何前处理,在基质中样品的含量-分析、制备都考虑,检测特性-有否紫外吸收?荧光?,找出样品中不同组份之间的差异,摸索条件的重要线索,极性问题,液相色谱的分离机理,正相,反相,体积排除,离子交换,其他,不同的分离模式是不同的机理,吸附色谱的分离机理,随着样品在固定相上的吸附能力由大到小,在色谱柱上的保留由长到短,吸附色谱概述,分离基于样品的极性差异。,洗脱次序一般为正相，即：极性低的先被洗脱,常用的流动相,非极性有机溶剂，如己烷,乙酸等为添加剂,常用固定相,硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。,优点,固定相稳定，不易流失,应用广泛，可使用多种溶剂,消除硅羟基的不良影响,缺点,pH值不能小于3,同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,体积排除色谱的分离机理,凝胶色谱概述,凝胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC）,分离基于分子在溶液中的体积大小,洗脱次序：大分子先被洗脱,流动相不参与分离，只起溶剂作用,分离效率低,色谱行为容易预测,GPC的校正,分子量大于V,0,或小于V,t,的分子不能分离,离子交换树脂的分离机理,离子交换色谱概述,适用于离子型化合物的分离,分离基于离子的带电特性,洗脱次序受多种因素的影响,填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团,样品分子特性,盐的种类、浓度,温度及pH值,有机溶剂,离子交换树脂的交换容量,液相色谱柱及分离机理的关系,从色谱方法上分,正相/反相,离子交换,分子体积排除,亲合,疏水回受,从柱子类型上分,分配/吸附,离子交换,凝胶,亲合,色谱柱化学及外形结构的关系,对HPLC柱的了解,平均颗粒度，颗粒度分布,颗粒度(dp),颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差),颗粒分布,颗粒分布越宽柱效低(渗透性差),颗粒形状,球型柱效高、重现性好、柱床结构均匀,无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展,对HPLC柱的了解（二）,平均孔径/孔体积,孔径/孔体积分布,大的孔径可分析高分子量的分子,对HPLC柱的了解（三）,键合相化学,影响化合物的分离度：,a,不同键合相对不同种类的化合物分离不同,可能导致色谱的分离机理不同,如：C18、C8、CN,对HPLC柱的了解（四）,含碳量,含碳量越高，k值越大（固定相传质效应增加）,高含碳量,有利于不易保留的化合物的分离,水解稳定性好，重现性好,有利于极性化合物的拖尾改善,低含碳量,有利于分析中性及碱性化合物,降低溶剂损耗,不同色谱柱的含碳量,色谱柱C%k苊,(50/50的乙腈/水),Symmetry C181917,Zorbax ODS1715.7,LiChrosorb RP-181510.3,Symmetry C81212.5,Resolve C-181212.4,Ultrasphere ODS1111.3,Partisil ODS-31112.0,m,Bondpak C-1810 7.9,Nova-Pak C-18 7 5.5,对HPLC柱的了解(五),填料的端基封口,封口残余硅羟基,减少不可逆吸附或拖尾,增加碳含量（0.1%-1%）,残基处理的效果,NovaPak C18,未封口 C18,抗坏血酸,烟酰胺,对氨基苯甲酸,哌咯西叮,核黄素,苯酚,盐酸硫胺,对HPLC柱的了解（六）,硅胶的活性,主要影响碱性化合物的保留行为：k,生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同,是选择性差异的主要来源,硅胶的杂质含量,重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小,是色谱柱质量好坏的重要标志,对HPLC柱的了解（七）,填料的稳定性,硅胶填料,pH：2-8,聚合物填料,pH：2-12,pH值小于2时键合相水解,Waters各种硅胶基质的色谱柱,Waters不同品牌的色谱柱,m,BondaPak,文献背景强,是工业标准,平均孔径125A，10,m,高活性、无定形硅胶,中等疏水性表面，端基封口。有独特选择性,Nova-Pak,平均孔径60A，4,m,高韧度低活性球形硅胶,低酸性，高疏水性，好的端基封口,有利于小分子物质的分析,Waters不同品牌的色谱柱,Resolve,平均孔径90A，5/10,m,低活性硅胶,非常高的疏水性，无端基封口,有利于低保留的中性及酸性化合物分离,Delta-Pak,有100A和300A两种孔径，5/15,m,硅胶,中到高的疏水性，端基封口,适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱,新一代硅胶基质的色谱柱,Symmetry,高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均10ppm,孔径100A，5,m,球形颗粒，端基封口,超高含碳量：C,18,/19%，C,8,/12%,表面积：300 m,2,/g,孔体积：1mL/g,特点,好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长,Waters聚合物基质的反相柱,特殊设计的多孔聚合物胶,有很宽的 pH 适应范围（2-12）,可用离子抑制方法分析碱性化合物,有非常不同的选择性,柱效及韧性比相应的硅胶柱低,色谱机理不太清楚,文献背景低，用户少,色谱柱的规格,内径,检测的灵敏度,样品的容量,长度,分离度，理论塔板数,速度,样品的容量,检测的灵敏度,