生物制药工艺学基因工程制药1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程制药,第一节 概述,第二节 基因工程药物的生产的过程,第三节 目的基因的获得,第四节 基因表达,第五节 基因工程菌生物代谢的特点,第六节 基因工程菌的不稳定性,第七节 基因工程菌中试,第八节 重组工程菌的培养,第九节 高密度发酵,第十节 基因工程药物的分离纯化,第十一节 变性蛋白的复性,第十二节 基因工程药物的质量控制,第十三节 基因工程药物的制造实例,第一节 概述,基因工程,的概念,基因工程又称为重组,DNA,技术或基因克隆技术,在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成,目的基因,，令其与载体构建成,重组,DNA,，再转移到,受体细胞,，目的基因在细胞中表达得到期望的由这个外源基因所编码的,蛋白质,获得新的遗传性状。,基因工程的诞生,打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流,，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景。,基因工程是,生物技术的核心,，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。,世界上第一个基因工程产品,人胰岛素,（美国，,1982,年）,中国第一个基因工程药物,1b,干扰素,（,1997,年）,美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。,为什么选择基因工程,传统制药,存在的问题：,A.,材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；,B.,内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不应求；,C.,由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制；,D.,提取中难免感染，后果严重。,基因工程技术,的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,基因工程技术可生产的药物和制剂包括,：,免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；,细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；,激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；,酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶,。,基因工程技术生产药品的优点：,a.,可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；,b.,可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；,c.,利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；,d.,内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；,e.,利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 源。,关于中国,20,世纪,70,主末，开始应用,DNA,重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品 改造传统制药工艺。,“,863”,高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。,我国基因工程药物主要集中在仿制上。,下游技术落后于上游技术,第二节 基因工程药物生 产过程,基因工程技术,是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌,(,或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术,基因工程药物制造的主要步骤,目的基因的克隆,构建DNA重组体,构建工程菌,目的基因的表达,外源基因表达产物的分离纯化,产品的检验,制备基因工程药物的基本过程,获得目的基因,组建重建质粒,构建基因工程菌,培养工程菌,产物分离纯化,除菌过滤,半成品检定,成品检定,包装,基因工程的上游和下游,目的基因,载体,重组,DNA,分子,重组,DNA,进入宿主细胞,转化,/,转染,工程菌大规模培养,表达,产物分离纯化,诱导,上游,下游,实验室,工厂化、产业化、商口化,基因工程重组菌构建示意图,上游阶段：,主要是,分离目的基因、构建工程菌,(,细胞,),。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。,下游阶段：,从,工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制,。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。,基因工程药物生产的上游和下游,第三节 目的基因的获得,克隆基因的常用方法：,基因组文库法（原核）,反转录法（真核）,PCR,法（原核,+,真核）,反转录,-,聚合酶链反应法（真核）,化学合成法（原核,+,真核）,旧基因改造法（原核,+,真核）,一 构建基因组文库分离目的基因,基因组,DNA（genomic DNA）,：,指代表一个细胞或生物体,整套遗传信息,（染色体及线粒体）的,所有,DNA,序列,。,基因组文库：,将某种细胞的,基因组,DNA,切成一定大小的,片段,，并与适当的,载体重组,后导入,宿主细胞,，这种含有,整个基因组,DNA,信息,的,集合。,基因组文库（,DNA,文库）构建流程,分离基因组,DNA,限制酶,大小不同酶切片段 片段酶切、回收、纯化,分别与适当的载体连接 载体,DNA,连接酶,导入细胞 转化或转染,克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑,鉴定 分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定,筛选,根据基因决定筛选策略,基因组文库法只适合原核基因的获得，不适用于真核基因。,Notice:,Why,?,原核基因与真核基因的区别,真核基因有,内含子,真核细胞中单拷贝基因只是染色体,DNA,中,很小一部分,，为其,10,-5,-10,-7,，即使多拷贝基因也只有,10,-5,，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极其困难,真核基因的反转录克隆法,二 反转录法,从真核细胞中提取,mRNA,，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成与该,mRNA,互补的,DNA,（,cDNA,第一链），再以,cDNA,第一链为模板，最终合成双链,DNA,序列。,cDNA,不含内含子。,获得,cDNA,文库。,反转录合成基因的步骤：,mRNA,的纯化 ,cDNA,第一链的合成 ,cDNA,第二链的合成 ,cDNA,的克隆 将重组体导入宿主细胞 ,cDNA,文库的鉴定 目的,cDNA,克隆的分离和鉴定,cDNA,克隆示意图,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,逆转录酶,ds-cDNA,ds-cDNA,RNaseH,酶解除去,mRNA,DNA,聚合酶,I,核酸酶,S1,1.mRNA的纯化,细胞内含有3种以上的,RNA,，,mRNA,占细胞内总,RNA,总量的2%5%，,真核细胞中,mRNA,的3,-,末端含有一多聚腺苷酸,polyA,组成的末端，足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸,Oligo(dt)-,纤维柱上，可用亲和层析法将,mRNA,从细胞总,RNA,中分离出来。,2.,cDNA,第一链的合成,可用寡聚脱氧胸苷酸（,dt,）作为引物，在反转录酶作用下，开始,cDNA,链的合成。,3.cDNA,第二链的合成,除去,cDNA-mRNA,杂合链中的,mRNA,链（碱解或,RNaseH,酶解）,然后以,cDNA,第一链为模板开始合成,cDNA,第二链。由于第一链,cDNA3-,末端会形成发夹结构，所以可从这点开始合成第二链（,Klenow,酶或,DNA,聚合酶,I,）,切除发夹结构（核酸酶,S1,，专一性切除单链,DNA,）,4.cDNA克隆,用于,cDNA,克隆的载体有两类：,质粒,DNA,（,如,pUC,、,pBR322,等）,10kb,根据重组后插入的,cDNA,能否表达、转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为：,表达型载体,（,pUC,、,gt11,）有启动子,非表达型载体,（,pBR322,、,gt10,）,5.,将重组体导入宿主细胞,以转化或转染的方向使重组,DNA,进入宿主细胞。,6.cDNA,文库的鉴定,目的：评价库的好坏,表型改变,抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变,结构特征,凝胶电泳、分子杂交、,DNA,序列分析,7.目的cDNA克隆的分离和鉴定,核酸探针杂交法,根据目的蛋白质的,氨基酸序列,，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，众,cDNA,文库中分离特异的,cDNA,克隆。,免疫反应鉴定法,用表达型载体构建的,cDNA,文库，可用免疫学方法逐一鉴定各,cDNA,的表达产物，即以某种蛋白质的,抗体,寻找相应的,cDNA,克隆。,三 PCR法直接克隆基因,PCR-,多聚酶链式反应,(Polymerase,chain reaction),PCR,是一种模拟天然,DNA,复制过程，在有,DNA,模板、,DNA,聚合酶、引物和四种,dNTP,的情况下，通过高温,变性,（,90-95),退火,，,延伸,这样反复循环的过程，在体外扩增特异性,DNA,片段的分子生物学技术。,可从基因组中、载体上扩增基因,PCR的条件,模板 双链DNA,引物,dNTP 原材料：A、T、G、C,DNA聚合酶 链的延伸,PCR三步曲,PCR,反应分三步完成：第一步,变性,-,9,5,高温下，双链,DNA,变性成,为,单链。第二步,退火,-,适当温度下，引物,DNA,结合在适于配对的,DNA,片断上。第三步,延伸,-,7,2,，由,DNA,聚合酶催化，从引物开始利用四种脱氧核糖核苷酸合成目的基因,DNA,。,PCR,原理示意图,四 反转录-聚合酶链反应法,反转录与聚合酶链反应（,PCR,）结合的方法：,mRNA,经反转录合成,cDNA,第一链后，不再合成,cDNA,第二链，而是在特异引物协助下，用,PCR,方法进行扩增，特异地合成目的,cDNA,链。,五 化学合成法,较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸序列或目的蛋白质的氨基酸序列，再按相应的密码子推导出,DNA,的碱基系列。,方法：合成目的基因,DNA,不同部位的,两条链的寡核苷酸短片段,，再退火成为,两端形成粘性末端的,DNA,双链片段,，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成,较长的,DNA,片段,，再用连接酶连接成完整的基因。,设计,合成,纯化,组装,化学合成基因的限制：,不能合成太长的基因。最长,50-60 bp,，只适用于克隆,小分子肽,的基因。,人工合成基因时，,遗传密码的简并,会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。,费用太高。,六 对旧基因的改造,蛋白质工程：,通过对基因功能相关区域的研究，采用,基因修饰技术,和,点突变技术,进行基因新功能研究和再确认，从而改变基因表达产物的生物学功能。,蛋白质工程药物的分子设计方法,定点突变某些关键氨基酸残基,增加、删除或调整分子上的某些肽段或结构域,功能互补的两种基因的融合,对表达产物的后修饰和改善,三种目的基因提取方法的优缺点,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,专一性最强,化学合成法,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性强,反转录法,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,操作简便广泛使用,基因文库法,缺 点,优 点,