生化工程第五章微生物培养及发酵动力学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 微生物培养及发酵动力学,内容,1,基本概念,2,微生物反应的物料衡算,3,微生物反应的能量衡算,4,微生物反应动力学,微生物生长的基质,二 微生物反应过程的质量衡算,例题：,(,选自贾士儒,48,69,页,),1.,葡萄糖为基质进行面包酵母（,S.cereviseae,）培养，培养的反应式可用下式表达，求计量关系中的系数,a,、,b,、,c,、,d,。,反应式为：,C,6,H,12,O,6,3O,2,aNH,3,bC,6,H,10,NO,3,(,面包酵母,),cH,2,O,dCO,2,解：据平衡方程式,可得：,C:6=6b+d,H:12+3a=10b+2c,O:6+6=3b+c+2d,N:a=b,方程联立求解为：,a=b,0.48,c=4.32,d=3.12,上述反应计量关系式为,:,C,6,H,12,O,6,3O,2,0.48NH,3,0.48C,6,H,10,NO,3,4.32H,2,O,3.12CO,2,练习,1,葡萄糖为碳源，,NH,3,为氮源进行酿酒酵母发酵。呼吸商,1.04,。消耗,100mol,葡萄糖和,48mol NH,3,生产了,48 mol,菌体、,312 mol CO,2,和,432molH,2,O,。求氧的消耗量和酵母菌体的化学组成。（呼吸商,RQ,CO,2,生成速率,/O,2,消耗速率）,第二节 微生物反应过程的得率系数,研究得率系数的意义,：,对碳源等物质生成细胞或其他产物的潜力进行定量评价的重要参数。,分为以下几类：,部分菌体得率与产物得率,得率 定义单位,Y,X/S,消耗,1g,或,1mol,基质获得的干菌体克数，,g/g,g/mol,Y,ATP,消耗,1molATP,获得的干菌体克数，,g/mol,Y,KJ,消耗,1KJ,热量获得的干菌体克数，,g/KJ,Y,X/O,消耗,1gO,2,获得的干菌体克数，,g/g,Y,X/H,1mol,氢受体产生的干菌体克数，,g/mol,Y,X/N,消耗,1g,氮产生的干菌体克数，,g/mol,Y,X/NO3-,消耗,1mol,NO3,获得的干菌体克数，,g/mol,Y,CO2/S,消耗,1mol,基质产生的,CO,2,的摩尔数，,mol/mol,Y,CO2/O,消耗,1mol O,2,产生的,CO,2,的摩尔数，,mol/mol,Y,ATP/S,消耗,1mol,基质获得的,ATP,的摩尔数，,mol/mol,Y,ave-,消耗,1,个有效电子获得的干菌体克数，,g/ave,细胞得率（生长得率）,:,Y,X/S,生产细胞的质量,g/,消耗基质的质量,g,X/,（,-S,）,碳元素的细胞得率,:,Y,C,细胞生产量,细胞含碳量,/,基质消耗量,基质含碳量,Y,X/S,(Xc/Sc),1,葡萄糖为碳源，,NH,3,为氮源进行某细菌的好氧培养。消耗的葡萄糖有,2/3,的碳源转化为细胞中的碳。反应式为：,C,6,H,12,O,6,aO,2,bNH,3,c(C,4.4,OH,7.3,N,0.86,O,1.2,),dH,2,O,eCO,2,计算上述反应中的得率系数,Y,X/S,和,Y,X/O,解：据平衡方程式,可得：,C:6=4.4c,e,H:12+3b=7.3c+2d,O:6+2a=2.2c+d+2e,N:b=0.86c,由于,1mol,葡萄糖中含碳,72g,转化为细胞内的碳为,722/3=48(g),故：（,4.412,）,c=48,得：,c=0.91,转化为,CO,2,的碳为,72,48,24,（,g,）,故：,12e=24 e=2,解平衡方程中其他未知数，得：,b=0.78;d=3.85;,a=1.47,故平衡方程为：,C,6,H,12,O,6,1.47O,2,0.78NH,3,0.91(C,4.4,OH,7.3,N,0.86,O,1.2,),3.85H,2,O,2CO,2,Y,X/S,0.91,（,12,4.4,16,7.3,14,0.86,16,1.2,）,/180,0.46(g/g)(,以细胞,/,葡萄糖计,),Y,X/O,83.1/,（,1.47,32,）,1.77(g/g)(,以细胞,/,氧计,),第三节微生物反应过程的能量衡算,微生物反应是放热过程。,微生物利用碳源，通过呼吸（有氧）或发酵（无氧）将能量转化为,ATP,，供微生物生长、代谢，其余能量作为热量排出，进行微生物优化培养时，必须进行适宜的温度控制。,从反应热的角度考虑反应过程中的能量代谢，进行能量衡算。,一 菌体得率,1,Y,KJ,：微生物对能量的利用,(,消耗,1KJ,热量获得的干菌体克数，,g/KJ),Y,KJ,X (,细胞生产量,),Ea(,细胞贮存自由能,)+Eb(,分解代谢释放自由能,),(-H,a,)(X)+(-H,c,),H,a,:,菌体,X,的燃烧热为基准的焓变，因菌体不同，一般,取值,H,a,22.15kJ/g,H,c,:,所消耗基质的焓变与代谢产物焓变之差，,H,c,(-Hs)(-S)-(-H,p,)(P),(-H,0,*,)(-O,2,),Hs:,碳源氧化的焓变，,kJ/mol,；,H,p,:,产物氧化的焓变，,kJ/mol,；,H,0,*,:,为呼吸反应焓变,444 kJ/mol-O,2,故总表达式可写为：,Y,KJ,X,(-H,a,)(X)+(-Hs)(-S)-(-H,p,)(P),Yx/s,(-Ha)Yx/s+(-Hs)-(-H,p,)Yp/s,干酪乳杆菌在蛋白胨、牛肉膏为主要成分的复合培养基,中，分别以葡萄糖、甘露醇为能源进行培养，计算,Y,KJ,由化工手册查知：,H,葡萄糖,2816 kJ/mol,，,H,乙酸,870 kJ/mol,，,H,乙醇,1368 kJ/mol,，,H,甲醇,264 kJ/mol,，,H,乳酸,1363 kJ/mol,，,H,甘露醇,3038 kJ/mol,，,Ha,22.15 kJ/mol,能源,Yp/s,（,mol/mol,）,(,以产物,/,基质计,),Yx/s,（,g/mol,）,(,以细胞,/,基质计,),乳酸,乙酸,乙醇,甲醇,葡萄糖,0.05,1.05,0.94,1.76,62.0,甘露醇,0.4,0.22,1.29,1.6,40.5,解：以葡萄糖为能源时，,Y,KJ,Yx/s,(-Ha)Yx/s+(-Hs)-(-Hp)Yp/s,其中,:,(-Hp)Yp/s,13630.05,8701.05,13680.94,2641.76,2732,（,kJ/mol,）,Y,KJ,62.0,22.1562.0+2816-2732,0.043,（,g/kJ,）,以甘露醇为能源时,(-Hp)Yp/s,13630.4,8700.22,13681.29,2641.6,2925,（,kJ/mol,）,Y,KJ,40.5,22.1540.5+3038-2925,0.041,（,g/kJ,）,2,反应热（代谢热或发酵热）,H,h,基质燃烧热菌体燃烧热产物燃烧热,=HsS-H,x,X-H,p,P,例题：,葡萄糖为惟一碳源进行酵母培养。反应式为：,1.11C,6,H,12,O,6,2.10O,2,C,.3.92,H,6.5,O,1.94,3.42H,2,O,2.75CO,2,求（,1,）,Yx/s;,(2),生成,1kg,细胞量时的,H,h,。已知酵母细胞和葡萄糖的燃烧热分别为,1.5010,4,kJ/kg,和,1.5910,4,kJ/kg,。,解：,Yx/s,酵母细胞分子质量,/1.11,葡萄糖分子质量,3.9212,6.5,1.9416/1.11180,84.58/199.8,0.42,（,kg/kg,）,生成,1kg,酵母细胞需要葡萄糖,1/0.42=2.38(kg),H,h,HsS-H,x,X,1.5910,4,2.38,1.5010,4,1,2.2510,4,（,kJ,）,2.,分别采用含有蛋白胨和牛肉膏的复合培养基、含有多种氨基酸合成培养基和基本培养基进行单胞菌的厌氧培养。碳源为葡萄糖，获得如下结果,(,下表,),。已知菌体的含碳量（以碳源,/,细胞计）为,0.45g/g,求采用不同培养基时的,Y,kJ,.,化工手册可知,H,葡萄糖,2816kJ/mol,H,乙醇,1368kJ/mol,H,乳酸,1363kJ/mol,H,a,22.15kJ/mol.,培养基,Yx/s(g/mol),(,以细胞,/,葡萄糖计,),Yp/s(mol/mol),(,以乙醇,/,葡萄糖计,),Yp/s(mol/mol),(,以乳酸,/,葡萄糖计,),菌体中由葡萄糖所来碳元素的量,基本,4.1,1.5,0.2,1.0,合成,5.0,1.5,0.2,0.62,复合,8.0,1.6,0.2,0.48,一 发酵动力学研究内容：,研究,细胞生长速度,与,产物生成速 度,的关系及环境条件对速度的影响。,二 发酵过程的反应描述：,X,S,（底物）,X,（菌体）,P,（产物）,发酵反应动力学的研究内容,研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联,反应动力学模型,反应器特性,+,反应器的操作模型,操作条件与反应结果的关系，定量地在线控制反应过程,调整期,对数期,稳定期,衰亡期,时间,细菌数目的对数,某种细菌的生长曲线,二 微生物生长曲线,第一节 微生物生长动力学的基本概念,一、微生物在一个密闭系统中的生长情况：,时间,菌体浓度,延迟期,指数生长期,减速期,静止期,衰亡期,延迟期：,指数生长期,:,倍增时间,：,t,d,静止期：,;,衰亡期,:,一 指数生长方程,dX/dt=（,）X,X,为微生物的菌体浓度，单位体积内干细胞质量（,g/L）；,比生长速率，每单位细胞浓度的生长速率(1/,min;1/h)；,为细胞自溶或内源代谢速率，其导致细胞量的损失.,在 指数生长期，,故上式可改写为：,dX/dt=X，,积分变形为：,ln(X/X,0,)=t,或,t=ln(X/X,0,)/,或,X=X,0,e,t,第二节 微生物生长动力学,注：,1,）一般情况下，在微生物生长的各阶段，细胞增值规律,均符合指数生长定律,，但,值,随时间变化,；,2,）在,指数生长期,，,值达最大,m,，且保持稳定；其他生长期，,值随时间变化。,3,）表示微生物生长快慢的另一方法：,倍增时间,t,d,：,菌体细胞,质量增加一倍,所需的时间,t,d,=0.693/,例：,以乙醇为碳源进行产气杆菌培养，菌体初始浓度,X,0,=0.1kg/m,3,培养至,3.2h,菌体浓度为,8.44kg/m,3,，,若不考虑延迟期，而且,一定，求,t,d,二,Monod,方程,随温度、,pH、,基质浓度、产物浓度、溶氧等条件而变化.,f(s,p,T,pH,),Monod,发现：,在一定条件下,(,基质限制,),f(S),经验公式：,m,S/(Ks+S),：菌体的生长比速,（,1/h）,S,：限制性基质浓度,（,g/L）,Ks,：饱和常数,(,相当于1/2,m,时的限制性基质浓度,g/L,),max,:,最大生长比速,（,1/h）,：菌体的生长比速,S,：限制性基质浓度,Ks,：饱和常数,(,相当于1/2,m,时,的限制性基质浓度,g/L,),max,:,最大生长比速,（,1/h）,S Ks,时，,S,直线关系,S Ks,时，,m，,Ks,与,m,反映了微生物的特征：,基质,Ks,反映微生物对基质的亲和力：,Ks,小，亲和力大,Monod,方程的参数求解,(,双倒数法,),：,Ks,与,m,将,Monod,方程取倒数可得：,或：,这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出,Monod,方程的两个参数。,例,：,在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：,S(mg/l)6 33 64 153 221,(h,-1,)0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在该培养条件下，求大肠杆菌的,max,，,Ks,和,t,d,?,解：将数据整理：,S/100 137.5 192.5 231.8 311.3,S 6 33 64 153 221,max,，,1.11(h,-1,);,Ks,97.6 mg/L,t,d,ln2/,max,0.64 h,第三节 产物形成动力学,一、初级代谢产物和次级代谢产物,次级代谢产物：,还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显,的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等,这一类化合物称为次级代谢产物。,初级代谢产物：,微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。,如氨基酸、核苷酸等等，这些物质称为初级,代谢产物。,二、发酵动力学类型（,产物形成,和,菌体生长,关系,）：,一类发酵,偶联型,产物,的形成和,菌体,的生长相偶联,x,p,t,二类发酵,混合型,产物,的形成和,菌体,的生长部分偶联,x,p,t,三类发酵,非偶联型,产物,的形成和,菌体,的生长非偶联,x,p,t,浓,度,三,在,分批发酵,过程中，,微生物生长、产物形成,均与,基质利用,有关，因此可建立平衡方程：,微生物生长,：细胞积累生长,dX/dt=,X,产物形成,：产物积累产物合成,dP/dt=,X,Y,p/x,=,q,p,X,基质利用,：基质积累生长消耗产物消耗维持,dS/dt=,X/,Y,x/s,q,p,X/,Y,p/s,mX,=,q,s,X,q,p,X/,Y,p/s,mX,比速率（,、,q,p,、,q,s,）：,单位时间内单位细胞浓度所引起的,细胞生长,或,产物形成,或,底物消耗,的量。（,g/g,细胞.,h）,生长得率,Y,x/s,；,产物得率,Y,p/s,四.生产得率系数和产物得率系数,1.生产得率系数：,Y,x/s,表示每消耗1,mol,的基质所形成的菌体质量（,g）,Y,x/s,X/SX-X,0,/S,0,-S,Y,x/o2,表示每消耗1,mol,的,O,2,所形成的菌体质量（,g）,Y,x/s,X/O,2,Y,x/ATP,表示每消耗1,mol,的,ATP,所形成的菌体质量（,g）,Y,x/s,X/ATP,2.产物得率系数：,Yp/s,表示每消耗1,mol,的基质所生成的产物质量（,g）,Yp/s P/SP-P,0,/S,0,-S,五.分批培养的生产率,1.分批培养的生产率（,Productivity）：,生产率,P=,细胞或产物浓度（,g/L）/,发酵时间,t(h,）,其中：发酵时间,t=1/,m,ln,X,f,/X,0,+,t,c,+,t,f,+,t,l,t,c,为放罐清洗时间；,t,f,为装料消毒时间；,t,l,为生长停滞时间。,X,0,、,X,f,分别为细胞最初与最终浓度。,若令:,t,c,+,t,f,+,t,l,t,L,则：,P（,X,f,X,0,）,m,/,ln（X,f,/X,0,）+,m,t,L,1.在5,m,3,的培养液中按5%接种量接种，原接种液含菌510,6,（个/,mL），,求菌含量为410,9,（个/,mL）,的培养时间。（假定培养期间均,SKs,m=0.8 h,1,）,2.,采用合成培养基，在1,m,3,的反应器中对大肠杆菌进行分批培养，菌体生长可用,Monod,方程描述。已知,m=0.935 h,1,，Ks=0.71 kg/m,3,基质初始浓度,S=50 kg/m,3,，,菌体初始浓度,X,0,=0.1 kg/m,3,菌体得率,Y,X/S,=0.6kg/kg(,细胞/基质)。问:当80基质已消耗所需时间。,3.以甘油为基质进行阴沟气杆菌分批培养。时间,t=0，X,0,=0.1g/L,S,0,=50g/L.，,菌体生长可用,Monod,方程描述，,m=0.85 h,1,，Ks=1.2310,2,g/L，Y,X/S,=0.6kg/kg(,细胞/葡萄糖)。不考虑诱导期和死亡期，求培养6,h,后的菌体浓度及底物浓度。,第三节 连续培养及其动力学,连续培养（,cintinuous culture）,有称连续发酵，,以一定速度向发酵罐注入新鲜培养基，同时以同速排出培养液。使罐内液量维持恒定，使培养物在恒定状态下生长的培养方法。,连续培养与分批培养的区别：,维持恒定状态环境条件,如基质浓度,S,、产物浓度,P,、细胞浓度,X,、比生长速率,、,pH,等始终维持不变,维持恒定状态目的：,稳定高效,的,培养微生物,或产生大量代谢,产物,。,一 单罐连续发酵的前提和假设：,稳定状态下物料平衡，参数变化为零,：,dX/dt,=0,dS/dt,=0,dP/dt,=0；,培养基混合均匀，菌体、基质、含氧等均匀一；,微生物无死亡（,比死亡速率,0,）,F(L/h),X,(g/I),S,(g/I),F,(L/h),So,(g/I),V,=,液体体积(,L),X,s,单罐连续培养,流入速度,=,流出速度,=F,反应器内,(V),全混流溶质浓度处处相等,连续反应器：,二 单罐连续发酵的动力学,通过连续培养的物料衡算来推导其动力学方程：,微生物细胞的物料平衡：,积累细胞（进入流出）细胞（生长死亡）细胞,dX/dt,=F（X,0,X）/V()X,由于流入细胞浓度,X,0,0，0，,故简化为,:,dX/dt,=FX/,VX（F,/V）X,稳定态下:,dX/dt,=0,则：,F,/V,连续培养中,，稀释率（,dilution rate）D=F/V,故：,D,D(1/h)：,单位时间内新进入的培养液体积（,F）,占罐内培养液总体积(,V),的分数。,1/,D(h)：,培养液在罐内的平均停留时间，可用,t,表示,注：,D=F/V，,可通过改变,F（,流加速率）调节,值：,D0,微生物浓度将随时间而增加；,D,则,dX/dt 0,微生物浓度将随培养物被洗出（,wash out）,而减少；,D,则,dX/dt 0，,微生物浓度不随时间而变化，处于恒态,连续培养稳定状态,限制性底物的物料平衡：,底物积累（进入流出）底物（生长形成 产物维持代谢）底物,dS/dt,=F,（,S,0,S）/V（X/Y,x/s,q,p,X/Y,p/s,mX）,由于,mXX/Y,x/s,，,产物形成的需求（,q,p,X/Y,P/s,）,忽略时，该式简化为：,dS/dt,=F,（,S,0,S）/VX/Y,x/s,稳定态下,dX/dt,=0,则：,D,（,S,0,S）=,X/Y,x/s,当稳定态,D=,时，,XY,x/s,（,S,0,S）,（1）,其中,：,S,0,，S,流入和流出的营养底物的浓度（,g/L）；,F,培养液体积流量（,L/h）；,V,反应器容积(,L)；,m,维持系数（,g,基质/,g,细胞.,h）；,比生长速率（,h,1,）；,Y,x/s,以消耗基质为基准的细胞得率,（,g,细胞/,g,基质）；,Y,p/s,以消耗基质为基准的产物生成率,（,g,产物/,g,基质）,3,）细胞浓度与稀释率的关系,据,Monod,方程:,m,S/(K,s,+S),当稳定态,D=,时,D,Dc S/(Ks+S),Dc:,临界稀释速率,（,Dc=m）,代表能运行的最大稀释,速率。,一般情况下,DDc,；,DDc,则菌体将被洗出,上式变形为：,SDKs/(,m,-D),(2),(1),(2),合并：,XY,x/s,S,0,DKs/(,m,-D),（3）,注：,连续培养的稳定状态下，,Y,x/s,、S,0,、Ks,及,m,均定值，故,菌种浓度,X,、底物浓度,取决于,稀释率,D,。,连续培养的稳定状态下，,X、S,0,、D,为主要变量，其他属于因变量。但当,D,发生改变，均会造成,X、S、,的变化。,菌种浓度,X、,基质浓度,S、,细胞产率,P,及稀释率,D,的,变化,关系,如图,：,菌种浓度,X,与稀释率,D,的关系,：,随,D,增加，,X,逐渐减少，起初,不明显，当,D,渐接近,Dcm，,X,急跌至0，微生物全部洗出。,基质浓度,S,与稀释率,D,的关系,：,S,变化与,X,相反：一般当,D1,则1+,C,1，,即,D，,但不存在微生物将随培养物被洗出（,wash out）,减小的危险,限制性底物的物料平衡：,底物积累（进入流出）底物消耗底物再循环进入底物,dS/dtFS,0,/V(1+)FS/VX,1,/Y,x/s,+FS/V,该式简化为：,dS/dt,=D（S,0,S）X,1,/Y,x/s,稳定态下,dS/dt,=0，D（S,0,S）=X,1,/Y,x/s,则：,X,1,DY,x/s,/（S,0,S）,因,D（1+C），,X,1,Y,x/s,/（S,0,S）（1+C）,(1),据,Monod,方程:,m*S/(Ks+S),又：,D（1+C）,则：,SDKs（1+C）/m-D（1+C）,(2)(1)(2),合并,得：,X,1,Y,x/s,/（1+C）S,0,DKs（1+C）/,(m-D（1+C）),（3）,