实验室检测技术概要.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验室检测技术概要,主要内容,概述 疾病鉴别诊断过程,临床症状和大体病变检 病料的采集及处理,实验室检验,病料中细菌的检测,病料中病毒的检测,一 、疾病鉴别诊断过程,临床标本的采集及处理,原则,合理的采样时机,正确的采样方法,适宜的采样部位,一、标本采集,尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。,1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。,2 鼻、咽及肛门拭子,3 粪便标本,4 脑脊髓液、心包液、尿液等,5 尸体材料,死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。,不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。,二 标本的保存和运送,尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4；时间延误较长，置-70。,如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。,三 标本处理,1 体液 可以直接接种、检测,2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测,3各种拭子,4粪便标本,5 组织材料,病原学检测常用的实验室技术,分离培养（“金标准”）,形态学检查（病毒 电镜镜检）,细菌的生化试验,动物实验,免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化,分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR,二、病料中细菌的检测方法,细菌的形态学检查,细菌的分离培养,细菌的生化试验,动物试验,血清学试验,分子生物学方法,光学显微镜下细菌的形态,细菌的形态观察,光镜和电镜的比较,大肠杆菌,葡萄球菌,电镜镜检,光学显微镜镜检,培养结果,初次分离,纯培养,鉴别培养,不乳糖,发酵乳糖,麦康凯平板,不发酵乳糖的细菌,大肠杆菌，呈现黑色金属光泽,EMB平板,SS平板,大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,发酵乳糖的某种肠杆菌。,HE（苏木素伊红)琼脂平板,本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。361培养1824h，观察结果。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球菌生长被抑制。,革兰氏染色,革兰氏阳性,革兰氏阴性,染色原理及过程：,初染,（结晶紫）,媒染,（碘液）,脱色,（95酒精）,复染,（复红）,细菌的生化试验,硫化氢试验,糖发酵试验,MR试验,VP试验,靛基质试验,药敏试验示意图,测量抑菌圈,涂布细菌,贴上药敏纸片,1,2,温箱培养,3,4,以大肠杆菌为例：,剖检（采集病料）,纤维素渗出物的涂片染色,分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板）,培养物涂片,G,染色,生化试验,动物试验,血清学实验 玻板凝集鉴定血清型,三、病料中病毒的检测,电镜技术,血清学试验,分子生物学技术,病毒的分离鉴定,标本采集与送检,病毒分离和鉴定的一般程序,常用检测方法,分离培养,血清学,中和试验,补体结合试验,血凝及血凝抑制试验,免疫扩散试验,免疫学诊断技术,ELISA,IFA 免疫组化,分子生物学检测,PCR,分子杂交技术,病毒分离,标本采集,杀灭杂菌,（,青链霉素,）,接种,鉴定病毒种型,易感动物,出现病状,鸡胚,病变或死亡,细胞培养,细胞病变,三大方法,1动物接种,病毒的分离与鉴定,2,鸡胚培养,3组织培养,病毒中和试验,本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体等。,virus,补体结合反应,Ag,Ab,红细胞,溶血素,补体,Ab,Ag,红细胞,补体,溶血素,溶血 （,-,）,不溶血 （+）,免疫扩散,电镜技术,鸡痘病毒（超薄切片）,狂犬病毒包涵体（Negri body）,ELISA分类,ELISA Procedures,分子生物学方法,PCR,(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应),荧光实时定量PCR（real time PCR）,NASBA（依赖核酸序列的扩增）,PCR原理:,实质就是,体外基因复制技术,Mg,2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq,DNA聚合酶,AmpErase,Primer,靶序列,加热变性95,C,靶序列引物退火55,C,引物延伸72,C,原理图示,一,二,三 完成一个循环,30次循环后靶序列扩增的数量,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Amplicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,荧光定量PCR Taqman 技术,特异性荧光双标记探针,Taq,酶,53,外切酶活性,染料法的优点,：,成本低不需要探针；适合初步筛查先用,SYBR,筛查，再用,TaqMan,精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定,PCR,有无杂带、引物二聚体；,染料法的缺点,：,无模板特异性 不能分辨主带与杂带,，给出的是总信号；不能做多重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于,5000,拷贝以上的基因定量。,与,DNA,结合时发光,游离时不发光,SYBR Green I染料法,举例：,基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定量PCR方法。实验结果：,图2.3：标准曲线,引物二聚体,1copy,图2.4 融解曲线,10copies/,uL,1copy,/ul,阴性对照,10,5,copies/,ullL,10,7,copies/,uL,10,6,copies/,uL,图2.5:重复性及灵敏度检测,1,3,4,2,图2.6 特异性检测,1）,牛型分枝杆菌,；2）,结核分枝杆菌,；3）,BCG,；4）,阴性对照,市场上常见的实时荧光PCR仪,罗氏Lightcycler,MJ opticon2,伯乐icycler,ABI7000,杭州博日（原大和）linegene,谢谢！,